血栓栓塞性疾病为临床常见病,严重危害着人类的生命和健康。其病因及发病机制十分复杂,迄今尚未完全阐明,目前认为血小板功能异常和血管内皮细胞损伤是血栓形成的重要因素。血栓形成是心脑缺血性疾病的主要致病因素之一。研究表明,脑缺血时,血小板功能异常亢进,血液处于高凝状态,这是造成继发性脑损伤的重要原因之一。可见,抗血小板聚集药物的开发与应用是治疗脑血管疾病的有效手段,寻找有效的抗血栓药物具有重要的临床意义。2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐(dl-PHPB)是中国医学科学院药物研究所自行设计合成的全新化合物,并已被国家食品药品监督局批准作为抗缺血性脑卒中新药进行临床研究。我室前期研究结果表明,dl-PHPB能够显著缩小大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)后的脑梗死面积,改善神经功能缺失症状,减轻脑水肿体积,增加局部脑血流量,抑制大鼠血.小板聚集和血栓的形成。但对其抗血小板聚集、抑制血栓形成的作用机制没有深入研究。本研究主要从血小板活化、聚集、凝血系统、纤溶系统以及血管内皮细胞保护等几方面观察dl-PHPB的作用,并研究其机制,以期寻找其作用靶点。同时与其它的活血化淤中药,如葛根素和丹酚酸B相比较,为进一步阐明中药抗血小板聚集的机制,开发更有效的抗血小板中药提供理论和实验依据。血小板功能活化亢进是血栓形成的重要因素,我们首先研究了dl-PHPB对血小板功能的影响。血小板聚集活性的检测一直是血小板体外功能评价的金标准,本次研究采用体内给药,体外检测的方法,观察了dl-PHPB对血小板聚集功能的影响。结果发现,dl-PHPB可剂量依赖性地抑制AA、COL、ADP诱导的血小板聚集,且对ADP引起的血小板聚集的抑制作用最强。在本研究中我们以ADP为诱导剂,探讨了dl-PHPB对血小板聚集的信号通路的影响及可能的作用靶点。ADP与血小板膜上的G蛋白受体结合,目前已知ADP受体主要有P2Y1和P2Y12两种受体亚型。P2Y1偶联Gq蛋白,激活PLCβ,水解PIP2产生IP3和DAG,引起钙离子释放,增加胞浆[Ca2+]i；P2Y12偶联Gi蛋白,抑制腺苷酸环化酶,降低cAMP,最终引起血小板聚集。本研究结果显示,无论细胞外液是否存在Ca2+,dl-PHPB均能明显降低ADP诱导的血小板胞浆游离钙含量,而且对内钙释放的抑制作用强于抑制外钙内流。同时dl-PHPB增加磷酸化PLCβ(ser1105)的蛋白表达,不影响PLC总蛋白的表达。PLC激动剂部分逆转dl-PHPB的抗血小板聚集作用。dl-PHPB明显抑制ADP引起的血小板IP1含量增加,对PLC激动剂引起的IP1增加无明显影响。以上结果表明,P2Y1受体参与了dl-PHPB的抗血小板聚集作用。PGE1可使血小板中cAMP含量迅速增加,ADP与P2Y12受体结合,降低cAMP含量,拮抗PGE1的作用。抗血小板药噻氯匹定拮抗ADP与P2Y12受体的结合,增加cAMP含量。研究结果显示dl-PHPB并不影响cAMP的含量,与噻氯匹定的作用不同。同时dl-PHPB对PI3K、Akt及磷酸化Akt的蛋白表达无明显影响,提示dl-PHPB并不通过P2Y12受体信号通路发挥作用。凝血系统和纤溶系统、PGI2和TXA2的动态平衡,同样影响血小板的聚集功能。本研究检测了静脉给予dl-PHPB对大鼠凝血系统功能、纤溶系统活性以及PGI2和TXA2含量的影响。结果显示dl-PHPB增加大鼠血浆6-keto-PGF1α含量,减少PAI-1含量,对凝血时间、血浆中t-PA和TXB2的含量无影响。另外,我们也观察了dl-PHPB对血小板活化功能的影响,结果显示dl-PHPB显著降低血小板表面CD62P的表达,抑制了血小板活化。血管内皮细胞功能的完整性对于维持血液的正常流动和抗血栓功能的发挥起着非常重要的作用。本研究以离体培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为实验对象,观察了dl-PHPB对脂多糖(LPS)损伤的内皮细胞的保护作用,同时检测了各组中黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达。结果显示,不同浓度的LPS作用24h后,HUVEC存活率明显下降,黏附分子ICAM-1和VCAM-1的释放量明显增加。dl-PHPB提高了LPS损伤的内皮细胞的存活率,抑制ICAM-1的释放,对VCAM-1含量无明显影响。以上研究结果提示,dl-PHPB明显抑制血小板聚集、增强纤溶系统活性,抑制血小板活化,升高PGI2/TXA2比值,保护损伤内皮细胞,抑制细胞间黏附分子ICAM-1的释放,对凝血系统活性没有影响。dl-PHPB通过拮抗P2Y1受体,抑制PLC活性,降低血小板胞浆游离钙浓度,抑制血小板活化,从而抑制了ADP诱导的血小板聚集。与临床使用的抗血小板药物噻氯匹定的作用靶点并不相同。传统的活血化瘀中药有很多具有抗血小板作用,但对其研究多集中于一些表面现象的研究阶段,缺乏对抗血小板作用机制的深入研究。葛根素和丹酚酸B是两个传统的活血化瘀中药,具有明显的抗血小板聚集,抑制血栓形成的作用,广泛用于缺血性心脑血管疾病。本研究也观察了葛根索和丹酚酸B对多种诱导剂诱导的血小板聚集的抑制作用,并对其抗ADP诱导的血小板聚集的机制与dl-PHPB进行比较,旨在寻找其作用靶点的异同,为祖国中药的进一步开发和深入研究提供依据。本研究结果显示,葛根素和丹酚酸B均明显抑制ADP诱导的大鼠血小板聚集。其中葛根素抑制ADP引起的IP1蓄积,但对PLC激动剂引起的IP1蓄积没有作用,这一结果提示,P2Y1受体-PLC信号通路参与了葛根素的抗血小板聚集作用,与dl-PHPB作用靶点相似；丹酚酸B对ADP和PLC激动剂引起的IP1蓄积均无明显抑制作用,提示丹酚酸B抗血小板聚集作用并不通过PLC这条信号途径。葛根素和丹酚酸B对血小板PI3K和Akt及磷酸化Akt蛋白表达均无影响,提示葛根素和丹酚酸B抗血小板聚集作用与PI3K-Akt信号通路无关,这一作用与dl-PHPB相同。以上结果说明不同中药其单体活性结构不同,抗血小板聚集的靶点也是多样的。因此对中药的抗血小板机制进行深入研究,对开发来自天然产物的抗血小板新药具有重要的指导意义。