2,3-丁二醇（2,3-Butanediol,简称2,3-BD）是一种重要的生物基碳四平台化合物,在食品、化工、制药及燃料等领域具有巨大的应用前景。由于满足可持续发展理念,微生物发酵法产2,3-BD日益受到瞩目。然而,2,3-BD的工业发酵长期以来面临着三个瓶颈问题:（1）发酵底物成本相对偏高;（2）需要消耗大量宝贵的淡水资源;（3）发酵过程容易染菌。为解决上述问题,本研究基于地衣芽孢杆菌和肺炎克雷伯菌这两种具有工业化潜力的2,3-BD生产菌种,开发了性能优异的微生物细胞工厂。相关研究旨在提高微生物发酵法产2,3-BD的竞争力,以推进绿色高效合成2,3-BD的工业化进程。本研究的主要成果如下:1.模块化代谢工程改造地衣芽孢杆菌MW3,成功实现了以廉价非粮的菊粉为底物高效合成2,3-BD。改造的模块包括菊粉水解模块、芽孢形成消除模块、碳代谢流重分布模块和对映体纯meso-2,3-BD合成模块。首先,通过引入内切型菊粉酶,强化了菊粉糖化速率和2,3-BD合成效率;紧接着,通过敲除spoIIE基因阻断了芽孢的产生,加强了发酵过程中对工程菌的控制;在此基础上,通过alsS基因起始密码子替换、acoR基因敲除和副产物合成途径阻断策略,将更多的碳流疏导至2,3-BD合成途径;最后,敲除了甘油脱氢酶基因gdh,使得工程菌合成手性纯meso-2,3-BD。通过以上改造获得的工程菌MWO-8经分批补料发酵可产82.5 g/L的meso-2,3-BD（手性纯度高达99.3%）,生产强度和产率分别为1.38 g/L/h和0.439 g/g。据我们所知,82.5 g/L的meso-2,3-BD产量是迄今为止在无外源添加菊粉酶的情况下同步糖化发酵菊粉产2,3-BD的最高水平。2.考察了工程菌MWO-8的耐盐胁迫能力,并研究了其耐盐胁迫机制。结果发现,低浓度NaCl（1%～5%）对细胞生长无明显影响,而高浓度NaCl（6%～7%）对细胞生长具有显著的抑制作用。随后,通过转录组分析发现,渗透调节和应激反应是MWO-8耐盐胁迫的两种主要策略。在渗透调节方面,MWO-8主要通过吸K+排Na+作用、胞内积累相容性溶质脯氨酸调节渗透压以迅速适应盐胁迫,并证实了在盐胁迫条件下脯氨酸的合成由操纵子proHJAA介导;在应激反应方面,由σB因子调控的一般应激反应扮演着主要作用,而ECF σ因子调控的特异性应激反应起相对次要作用。3.基于MWO-8良好的耐盐特性,探讨了以海水替代淡水作为发酵用水产2,3-BD的可行性。摇瓶发酵结果表明,在海水培养基中,2,3-BD产量为27.5 g/L,发酵周期为26h,最大生物量OD600为15.58。与之相比,在常规发酵培养基中,2,3-BD产量为48.5 g/L,发酵周期为16 h,最大生物量为21.72,表明在海水培养基中MWO-8的发酵性能显著下降。为了强化MWO-8在海水培养基中的发酵性能,通过逐步提高种子培养基的含盐量对MWO-8进行了适应性预培养,使得2,3-BD产量提高至31.7g/L,发酵周期缩短至22h,最大生物量提高到18.24。随后,通过在海水培养基中添加甜菜碱,使得2,3-BD产量和最大生物量进一步提高到34.6g/L和19.37,发酵周期缩短至20h。最后,采用改进后的发酵策略在海水培养基中同步糖化发酵菊粉,可产27.8 g/L的2,3-BD。4.从营养源摄取角度出发,对具有抗杂菌污染系统的肺炎克雷伯菌KP-OU7进行改造,实现了 2,3-BD的非灭菌发酵。首先,研究发现KP-OU7具有亚磷酸盐和尿素利用基因簇,能够在亚磷酸盐和尿素作为磷源和氮源的营养缺陷型MOPS培养基中生长,而其他微生物无法同时吸收亚磷酸盐和尿素,会因“饥饿”而死亡,因而能极大的降低染菌风险;随后,敲除了副产物合成途径,强化了菌株发酵产2,3-BD的性能。进一步的,敲除了wabG基因并进行适应性实验室进化,以消除发酵菌株的致病性。最终,通过以上改造获得的工程菌KP-OU7-ME5在未灭菌的营养缺陷型MOPS培养基中,经分批补料发酵可产84.53 g/L的2,3-BD,生产强度和产率分别为1.17 g/L/h和0.38 g/g。