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研究背景胆管癌（Cholangiocarcinoma,CCA）是一种高度恶性的肿瘤,其起源于胆管上皮,根据其解剖部位的不同,CCA可分为三种亚型,即肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA）、肝门部胆管癌（perihilar cholangiocarcinoma,pCCA）和远端胆管癌（distal cholangiocarcinoma,dCCA）。CCA的不同亚型具有各自的特点（如危险因素的不同,发病机制的差异,治疗以及预后的差别等）。CCA在我国发病率高,早期诊断困难,预后极差,较发达国家来说,我国的诊疗水平远远落后。外科手术仍是胆管癌的治疗的首选方案;然而,由于CCA进展快,加之手术涉及的解剖结构复杂,根治性手术非常困难。而且多数患者发现较晚,这预示着根治性切除的可能性很小。通常来说,对于晚期CCA患者或失去手术机会的CCA患者,其中位总生存期大部分不超过1年。即使有一部分患者确诊时符合根治性手术的适应症,但行胆管癌的根治性切除术后,患者5年的总生存率也一般低于30%。除了手术之外,放、化疗对于胆管癌的患者治疗效果也是有限的。目前,这个精确治疗的时代,对于胆管癌的相关研究远远落后于其他如胃癌和肺癌等常见的肿瘤。导致这一现象的主要原因,可能包括:（1）胆管癌的总体患病率与其他肿瘤相比相对较低,很难建立一个比较大的研究队列;（2）CCA的手术治疗缺乏比较明确的手术指南,加之胆管癌手术做涉及的解剖位置复杂,患者标本获取困难,使CCA相关的实验开展难以持续;（3）大部分CCA患者在确诊时已经是癌症晚期,错过了行根治性手术以及其他治疗的最佳时期,往往导致CCA患者一个不良的预后,生存时间短,开展实验性治疗困难。因此,在我国开展与CCA相关的临床以及基础研究非常重要。直到2020年4月,才出现了胆管癌的第一个靶向药物培米替尼（Pemigtinib,INCB054828）,用于治疗存在FGFR2融合基因或突变的经治晚期胆管癌成年患者。自培米替尼被批准治疗FGFR2融合的胆管癌患者以来,培米替尼耐药的胆管癌病人已经被不断报道,但其耐药机制目前尚不完全清楚。基于胆管癌靶向治疗有限,耐药机制不明确,生物标志物缺乏,我们组建了三组接受根治性切除术的CCA患者,其中包括58例肝内胆管癌（iCCA）患者,123例肝门部胆管癌（pCCA）患者和101例远端胆管癌（dCCA）患者,进而想要寻找更多的与CCA预后相关的生物标志物、耐药机制以及CCA的治疗靶点,从而准确地预测CCA患者的术后风险并指导患者的个体化治疗。SOX9（SRY（性别决定区Y）框9）在许多组织和器官的胚胎发育中发挥重要作用,也是各种组织祖细胞的生物标志物。在成人的肝脏当中,SOX9显著在胆管细胞当中表达,通常被认为是胆道细胞命运的调节因子。虽然SOX9已被证明可以驱动胆管细胞的增殖和分化,但SOX9在CCA肿瘤发生和进展中的作用仍不清楚。先前有文献报道,在一个小样本量的iCCA队列中,SOX9被证明与化疗耐药性和不良预后相关。考虑到SOX9是Wnt-TCF/LEF信号通路的靶基因,也是胆管细胞命运的重要调控因子,我们通过生物信息学和实验验证进一步研究了 SOX9在胆管癌增殖中的作用机制。研究目的:1.基于8对临床样本的高通量测序,分析SOX家族中CCA组织与癌旁组织的表达差异,明确SOX家族中最显著的差异基因。2.基于TCGA癌症数据库,分析SOX9在36个CCA组织和9个正常胆管上皮组织中的差异表达情况,明确SOX9作为肿瘤标志物的潜在价值。3.利用CCA患者手术切除的组织标本,通过Western blot进一步探究SOX9在不同亚型的CCA中的表达情况。4.对CCA患者组织微阵列芯片（tissue mieroarray,TMA）进行免疫组织化学染色（immunohistochemical staining,IHC）,通过IHC评分将患者分为SOX9低表达或高表达的亚组,分析在不同亚型的CCA组织和癌旁组织中的表达情况;结合患者的术后随访,明确SOX9与CCA患者预后的关系。5.通过qPCR,Western blot等分子生物学技术及体内、体外实验,明确SOX9对CCA细胞增殖的影响。研究方法:1.对8对pCCA及癌旁临床样品进行高通量测序,计算pCCA及邻近正常组织中SOX家族的FPKM值,通过热图体现SOX家族的表达差异。2.借助TCGA数据库,下载TCGA数据库中与CCA相关的mRNA表达数据（包括36个CCA组织和9个正常胆管上皮组织）,通过非配对的t检验分析（unpaired t tests）,统计分析CCA组织和正常胆管上皮组织中SOX9 mRNA表达水平差异。3.选取4对iCCA,4对pCCA和4对dCCA患者的新鲜手术切除标本,通过qRT-PCR进一步明确SOX9在CCA和癌旁组织中mRNA的表达差异。4.选取2对iCCA,2对pCCA和2对dCCA患者的新鲜手术切除标本,通过western blot实验比较SOX9在不同亚型胆管癌之间,癌组织及癌旁组织之间的表达差异。5.收集自2010年1月至2020年12月期间于山东大学齐鲁医院接受胆管癌根治性手术患者的石蜡组织标本共计282例（包括iCCA 58例,pCCA 123例,dCCA101例）。将收集的组织标本制作成组织芯片,对组织芯片行IHC染色并对SOX9的表达进行评分。6.利用 ROC 曲线（receiver operating characteristic curve）分别计算得到 iCCA,pCCA和dCCA的cut-off值,使用cut-off值将患者两组,分别为SOX9低表达组和SOX9高表达组。通过Kaplan-Meier法和long-rank检验进行单因素生存分析,明确胆管癌临床病理特征及SOX9表达对患者预后的影响。通过使用Cox回归模型对结果进行多因素分析,明确SOX9是否是影响胆管癌预后的独立危险因素。7.构建慢病毒干扰和过表达载体,在胆管癌细胞中将SOX9进行敲低或过表达,通过CCK8,集落形成实验检测SOX9对CCA细胞增殖的影响。8.使用裸鼠建立皮下成瘤模型,明确SOX9对CCA细胞增殖能力的影响。研究结果:1.8对pCCA与癌旁组织高通量测序结果显示,SOX家族成员在CCA组织中表达显著高于癌旁组织且SOX9差异最明显。2.TCGA数据库中,SOX9在CCA组织中表达显著高于正常组织。3.qRT-PCR结果证实,iCCA,pCCA和dCCA组织中的SOX9的mRNA表达水平显著高于癌旁组织。4.Western blot结果证实,三种胆管癌亚型中的SOX9的蛋白表达水平显著高于癌旁组织。5.IHC评分显示,SOX9在iCCA,pCCA和dCCA组织中均有表达,且三种亚型CCAs中SOX9的IHC评分均明显高于癌旁组织的评分。6.单因素分析结果显示:SOX9的高表达与iCCA,pCCA及dCCA患者的不良预后均显著相关。7.SOX9过表达促进CCA细胞的增殖能力,而敲低SOX9得到了相反的结果。8.过表达SOX9能够促进裸鼠皮下成瘤模型中CCA细胞的增殖,敲低SOX9能够抑制裸鼠皮下成瘤模型中CCA细胞的增殖。研究结论:1.SOX9在iCCA,pCCA和dCCA患者的癌组织及癌旁组织中表达存在差异,即在癌组织中的表达显著高于癌旁组织。2.SOX9的高表达与iCCA,pCCA和dCCA患者的不良预后均显著相关。3.SOX9能促进CCA细胞的增殖能力。