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目的:结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,发病率和死亡率呈逐年上升趋势,给我国社会和经济发展带来沉重负担。我国每年新发结直肠癌病例429200人,死亡病例281400人,是第三常见的恶性肿瘤。结直肠癌最主要的死亡原因是复发与转移。虽然随着外科技术的不断进步,结直肠癌的生存率得到了提高,但肿瘤的转移以及复发仍给病人带来不良预后,给患者的疗效和生存质量带来严重影响。因此,寻找结直肠癌复发与转移的最佳治疗方法及深入研究结直肠癌复发与转移的关键机制,是目前结直肠癌研究领域中亟待解决的关键问题。树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素因子（Dendritic Cell Specific Intercellular Adhesion Molecule-3 Grabbing Non-integrin,DC-SIGN）是一种Ⅱ型跨膜蛋白,属于C型（钙依赖性）凝集素超分子家族。既往的研究多集中于DC-SIGN在免疫细胞（如树突状细胞、巨噬细胞等）中的生理和病理作用。近年来,有学者报道DC-SIGN不仅能表达于上皮细胞,还与上皮细胞来源的肿瘤生长和转移密切相关。但是DC-SIGN在恶性上皮细胞肿瘤中过表达的机制及其如何参与肿瘤进展与转移尚不明确。本研究旨在明确DC-SIGN参与结直肠癌侵袭转移的机制,为促进结直肠癌的治疗奠定理论基础和新的思路。方法:1.构建DC-SIGN慢病毒包被的sh RNA载体并建立DC-SIGN功能缺失稳定细胞模型。构建DC-SIGN和Lyn的过表达质粒,合成LEF1、TCF1、Lyn的si RNA,合成miR-185过表达和抑制剂sponge的质粒,转染细胞后分别用于各基因的过表达和抑制。2.Lo Vo和HCT116结肠癌细胞转染后,通过MTT细胞增殖实验和平板克隆形成实验分析细胞的体外增殖能力,划痕实验和Transwell实验分析细胞的体外侵袭迁移能力。3.利用裸鼠皮下成瘤实验和结肠癌转移模型分析细胞的体内生长和转移。4.应用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测细胞中相应分子的RNA水平和蛋白水平的表达。5.应用双荧光素酶报告基因实验分析miR-185与DC-SIGN的3′非翻译区的直接结合。6.应用人磷酸化激酶芯片筛选下游信号蛋白的磷酸化位点。7.通过免疫组化和原位杂交实验检测DC-SIGN、LEF1、TCF1及miR-185在结肠癌组织中的表达。8.应用细胞免疫荧光染色实验分析B-2刺激后相应蛋白的亚细胞定位。9.应用染色质免疫共沉淀实验分析转录因子LEF1/TCF1与miR-185启动子区域的直接结合。结果:1.沉默DC-SIGN表达在体内和体外抑制结肠癌细胞增殖和转移。DC-SIGN的sh RNA转染Lo Vo和HCT116细胞成功构建稳定低表达DC-SIGN的结肠癌细胞株。沉默DC-SIGN后细胞增殖和生长能力降低,与对照细胞相比,接种DC-SIGN低表达细胞的裸鼠成瘤体积和重量明显降低。并且沉默DC-SIGN后细胞侵袭和迁移能力降低,与对照细胞相比,接种DC-SIGN低表达细胞的裸鼠肝、肺转移瘤的荧光强度和转移瘤数量均明显降低。2.miR-185通过靶向DC-SIGN调控结肠癌的侵袭与转移。多个micro RNA-靶基因数据库筛选到miR-185可能结合DC-SIGN的3′非翻译区。miR-185能够抑制DC-SIGN的m RNA和蛋白表达。建立了miR-185的功能获得和缺失细胞模型,miR-185能通过DC-SIGN抑制结肠癌细胞的增殖。无论在体内和体外,miR-185能通过DC-SIGN抑制结肠癌细胞的侵袭迁移。与原位肿瘤相比,发生转移的结肠癌组织中miR-185的表达降低。miR-185通过DC-SIGN能抑制MMP-9和VEGF表达。3.DC-SIGN以Lyn依赖形式激活PI3K/Akt/β-catenin信号促进结肠癌转移。沉默DC-SIGN后Akt和GSK-3β的磷酸化水平,β-catenin的表达量明显降低。B-2刺激后,结肠癌细胞中磷酸酪氨酸增加。激活DC-SIGN能增加Akt和GSK-3β的磷酸化水平,但未影响其总蛋白水平,MMP-9和VEGF表达也增加,而PI3K抑制剂消除了这一作用。沉默DC-SIGN后LEF1和TCF1的水平明显降低。结肠癌细胞经B-2刺激后,部分细胞中β-catenin的定位从细胞浆向细胞核迁移。酪氨酸激酶Lyn在结肠癌细胞中与DC-SIGN表达水平一致。Lyn与DC-SIGN能相互作用,并且增加DC-SIGN的稳定性。激活DC-SIGN能招募Lyn和p85形成DC-SIGN-Lyn-p85复合物。Lyn抑制剂能逆转DC-SIGN激活促进的结肠癌转移。4.β-catenin/LEF1/TCF1直接抑制miR-185在结肠癌细胞中的表达。沉默DC-SIGN的裸鼠标本中miR-185的表达明显增加。B-2刺激结肠癌细胞后,miR-185的表达明显下降。而LEF1/TCF1的si RNA能够抑制该作用,提示LEF1/TCF1能反馈性调控miR-185的表达。生物信息学预测miR-185启动子区域存在多个潜在LEF1/TCF1结合位点。DC-SIGN激活后能促进LEF1/TCF1蛋白与-589至-575 bp区域DNA结合。结肠癌组织中DC-SIGN与LEF1、TCF1表达呈正相关。结合miR-185在组织中表达水平,miR-185与LEF1、TCF1表达呈负相关。结论:总结本项研究,我们发现了结肠癌细胞恶性进程中一条反馈通路。激活的DC-SIGN能通过增加PI3K/Akt信号诱导β-catenin入核结合转录因子LEF1/TCF1来促进MMP-9和VEGF的转录,并且抑制miR-185的表达从而导致其靶分子DC-SIGN的表达升高,进而促进结肠癌的转移。这项研究结果揭示了DC-SIGN-LEF1/TCF1-miR-185反馈环路在具有转移性的结肠癌细胞中的存在,有望为阻断结直肠癌侵袭转移提供新的靶点,对探讨结直肠癌精准治疗提供理论基础。