近年来,随着工业、建筑、交通等产业迅速发展,脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）患者的数量明显上升。SCI多发生于中青年人,常常导致终身残疾,给社会和家庭带来了沉重的负担,已成为一个重要的公共卫生问题。其主要临床症状表现为肢体的运动、感觉和自主功能的永久性丧失。随着干细胞研究的不断深入,干细胞移植疗法为SCI的治疗带来了希望。人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord Mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）作为干细胞研究领域中的一类重要细胞,其对于SCI治疗的作用同样受到广泛关注。第一章大连医科大学附属第一医院2015-2019年脊髓损伤住院病例回顾性分析目的:回顾性分析近5年大连医科大学附属第一医院住院治疗创伤性SCI病例,探讨近5年来SCI发生的主要损伤原因,发展的主要趋势,治疗的现状及SCI患者预后。从而更好的为SCI的预防、治疗、康复提供一定借鉴意义。方法:搜集2015年1月到2019年12月间,大连医科大学附属第一医院SCI住院患者病历资料,搜集内容包括:患者一般资料;受伤原因;损伤水平节段;ASIA评级;合并损伤;损伤程度;是否死亡;死亡原因;是否手术;药物治疗情况及预后等。对资料进行核查后录入计算机,按年龄、性别、损伤原因、损伤平面、损伤程度进行分组。应用SPSS19.0统计资料,对比国内外文献资料,进行统计分析。结果:以大连医科大学附属第一医院2015年-2019年SCI共384例住院患者为对象,探讨了SCI患者的主要临床特点。结果提示（1）SCI年龄范围为13--90岁,男女患者比为3.2:1,平均年龄53.41±13.73岁。SCI患者发病随着年龄的增长而增加,发病高峰年龄为40岁-70岁,占总人数的74.9%。（2）SCI损伤原因多为摔倒、车祸和重物砸伤。（3）SCI损伤部位颈段＞胸段＞腰段,分别占比88%,7.3%和4.7%。（4）SCI的死亡率为1.8%,死亡原因多为与SCI有关的呼吸系统并发症。ASIA-A级SCI患者死亡率最高,达1%;不良预后亦最高,达6.5%。（5）探讨了SCI患者治疗手段与预后的关系,提示手术治疗患者占比67%,保守药物治疗患者37%,超过1/5的SCI患者预后不良甚至死亡。仍缺乏有效改善SCI不良预后、尤其是危重症SCI患者的治疗手段。结论:创伤性SCI的治疗仍以支持性为主。对于重症SCI患者,预后仍然很差。为改变这一局面,今后应将重点放在预防损伤和开发有效的神经再生疗法上。第二章临床级hUC-MSCs制剂制备、标志物筛选及质控研究研究目的:通过标准化流程提取和培养hUC-MSCs,并对hUC-MSCs的生物学性状、表面标志物、多向分化潜能、干性标记物、成瘤性、质量控制等进行研究,建立了临床级hUC-MSCs制备、筛选和质控体系,为临床应用提供临床级别的干细胞制剂。研究方法:取足月健康剖宫产胎儿脐带,提取hUC-MSCs,贴壁培养。CCK8法绘制生长曲线。进行体外成骨、成脂及成软骨诱导分化。流式细胞术检测细胞表面标志物。软琼脂实验检测其成瘤性。免疫荧光法检测干性标记物Sox-2,Oct-3/4,Nanog;测定碱性磷酸酶（AP）活性,并对所有临床级hUC-MSCs制剂进行质控检测。研究结果:（1）人脐带组织块培养7-10d后多数组织块周围即可见新生细胞,培养至14-18 d时组织块周围细胞明显增多,达90%以上融合,细胞形态变得细长,类似成纤维样,放射状或漩涡状排列。（2）针对临床级干细胞制剂标准,筛选了临床级hUC-MSCs标志物。提示临床级hUC-MSCs表达CD13、CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD14、CD34、CD45、HLA-DR。（4）不同代次的临床级hUC-MSCs生长曲线相似,增殖活性无显著性差异。其中,P3和P5代细胞碱性磷酸酶（AP）表达明显高于P7和P11代。免疫荧光检测干性标记物SOX-2、Oct3/4、Nanog均呈阳性。（5）克隆形成法检测不同代次和批次临床级hUC-MSCs成瘤性,均呈阴性。（6）按临床级标准制备的hUC-MSCs具有较好的成骨、成脂及成软骨分化能力。（7）进一步优化了临床级hUC-MSCs质控标准,为临床前动物实验和临床研究提供了质量保障。结论:建立了临床级hUC-MSCs制剂制备、筛选、质控体系,为进一步探索细胞治疗在SCI中的应用提供可靠细胞来源。第三章临床级hUC-MSCs制剂在SCI模型小鼠治疗中的作用及抗炎机制研究研究目的:通过临床级hUC-MSCs移植对脊髓半横断模型小鼠运动功能、组织形态学、神经元、胶质细胞标记物免疫荧光和免疫组织化学、炎症因子相关通路蛋白检测,评价临床级hUC-MSCs制剂在动物模型中的安全性、有效性和可能机制,初步探讨hUC-MSCs对脊髓损伤保护作用及其可能的炎症调控机制。研究方法:根据第二章提出的标准,分别制备了1x10~7个/ml、2x10~7个/ml临床级hUC-MSCs制剂,建立了T10节段脊髓半横断小鼠模型。临床级hUC-MSCs制剂于造模同时,于损伤脊髓软膜下注射给药。观察干细胞移植后BBB评分、组织病理学状态、以及TUJ1,MAP2,Olig2,GFAP和Iba1免疫荧光、免疫组化情况,并进一步结合Western blot方法检测了炎症因子及几个主要的相关通路蛋白的表达变化。研究结果:（1）两种浓度临床级hUC-MSCs制剂脊髓半横断模型小鼠脊髓损伤处软膜下注射给药后8w,干细胞移植组瘫痪侧后肢BBB评分较对照组有显著性差异,高浓度组差异更明显（P＜0.01）。同时SCI模型小鼠自发运动能力及腓肠肌肌肉湿重明显改善。（2）给药不同时间组织形态学表现不同。HE染色发现,脊髓损伤4周及8周后,SCI组脊髓结构紊乱,细胞松散,损伤处出现明显空洞,髓鞘断裂;临床级hUC-MSCs移植后,细胞排列紧密有序;髓鞘结构较规则。尼氏染色结果呈现临床hUC-MSCs移植后4周和8周病灶处尼氏体分布与SCI组相比明显增多、密集。（3）临床级hUC-MSCs移植促进脊髓不同成分标志物表达水平明显改变。给药4周及8周后,与SCI组对比,临床级hUC-MSCs移植组TUJ1、MAP2、Olig2、GAP43表达较对照组高,而GFAP和Iba1表达hUC-MSCs治疗组较对照组下降。提示临床级hUC-MSCs干预增加了脊髓损伤区域神经元、轴突和髓鞘蛋白的表达,减少了神经瘢痕组织和炎性小胶质细胞的数量。（4）临床级hUC-MSCs制剂移植可以通过调控脊髓半横断模型小鼠炎症因子及相关通路蛋白的表达,促进SCI模型小鼠功能恢复。给药3天后SCI处炎症因子IL-6、IL-1β和COX-2表达量移植组较对照组和假手术组明显降低,但TNF-α及炎症通道蛋白NF-κB和TLR4表达量,移植组较对照组和假手术组明显升高。慢性期（干细胞移植后4w）,临床级hUC-MSCs移植组TNF-α表达和NF-κB表达较对照组下调;而上游信号通路蛋白Wnt 5a/β-catenin表达量移植组是上调的。结论:临床级hUC-MSCs可以保护神经元存活,促进轴突生长以及控制神经胶质瘢痕形成。临床级hUC-MSCs治疗脊髓损伤可能是通过调节TLR4/NF-κB途径和Wnt/β-catenin信号通路,调节了SCI动物的免疫炎症反应,通过以上机制,发挥对SCI的保护效应。第四章临床级hUC-MSCs治疗慢性脊髓损伤病例报道研究目的:评估慢性期脊髓损伤病人接受临床级hUC-MSCs移植治疗的安全性和有效性;进一步观察研究临床级hUC-MSCs移植对慢性期脊髓损伤病人神经学功能的恢复作用。研究方法:慢性胸段脊髓损伤病例1例,临床级hUC-MSCs移植方法为鞘内重复注射细胞数量为1.0*10~8个细胞/次,共4次,前3次每次间隔1个月,第4次与第3次间隔6个月。受试者将参加为期21个月的强化康复疗程。前3次移植手术后3日、1、2、4周,第4次移植术后3日、1、2、4周,12、24及48周进行神经功能（ASIA运动评分和感觉评分;ASIA残损分级;脊髓损伤行走指数水平（WISCI）;脊髓独立性量表评分（SCIM）;昆明步行量表（KLS）;痉挛改良Ashworth评分（MAS）;疼痛模拟视觉量表评分（VAS））、影像学、电生理、血液、脑脊液指标、安全性等评估。通过比较移植前后神经学评分的改变值,分析细胞移植的安全性、可行性和有效性。研究结果:1建立了SCI病例临床级hUC-MSCs移植临床评价体系。2通过神经病学评分,提示了慢性胸段SCI病例临床级hUC-MSCs移植治疗后,ASIA运动+感觉评分评分、脊髓独立性量表评分、改良ASHWORTH量表、疼痛VAS评分均较移植前有明显改善。3通过电生理评估,提示运动诱发电位（MEP）临床级hUC-MSCs移植治疗后较移植前有右侧运动皮层中枢到左下肢新出现的肯定波形;且改善一直持续到第4次干细胞移植后12个月。4通过临床级hUC-MSCs移植前后SCI病例血液、尿液、脑脊液化验指标随访,提示慢性SCI病例干细胞移植后慢性尿路感染得到控制;脑脊液免疫球蛋白及白细胞水平指标先上调后下调,提示临床级hUC-MSCs移植对中枢神经系统免疫具有调节作用;与第三章临床前研究机制相一致。结论:该慢性胸段脊髓损伤病例,经过4次续贯鞘内临床级hUC-MSCs移植治疗后,运动功能、感觉功能、独立性、运动诱发电位、疼痛、尿便、肌张力均得到一定改善,且无严重不良反应。