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RNA干扰是一种广泛存在于线虫、果蝇、斑马鱼、真菌和植物体内的转录后基因沉默现象。自从1998年被发现以来,已有大量的研究表明,转录产生的mRNA能在同源双链RNA(dsRNA)存在时完全降解,达到几乎与基因剔除相同的效果。因RNA干扰方法简便灵活,越来越多的被用于功能基因组学的研究。同时,RNA干扰在基因治疗领域也得到广泛关注。
杆状病毒是一类在自然界中仅感染节肢动物的病毒,属杆状病毒科。其基因组为环状双链DNA分子,大小在88-160kb。杆状病毒模式种苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)于1994年完成测序,含有154个可能的开放阅读框,目前已经鉴定的基因约只有70个。
在杆状病毒及昆虫细胞中,同样存在RNA干扰现象。已有研究表明,体外转录合成的dsRNA注入昆虫细胞,能够抑制侵染细胞的杆状病毒基因表达。将特异性针对gp64或者iel基因的dsRNA导入昆虫细胞甚至虫体,能够阻断杆状病毒的复制,并且使昆虫存活时间延长。
本研究设计构建了多种能表达dsRNA的载体,包括两个启动子构成双向结构、单个启动子表达长的反向重复序列和短发卡结构等。利用gfp基因作为报道基因,通过检测昆虫细胞中该基因的表达量来观察干扰效果。
用表达gfp的p402质粒与所构建的载体共转染昆虫sr21细胞的结果表明:果蝇Hsp70启动子表达长反向重复序列且带有AcMNPV增强子hr5的pT-hr5-HP-Dgfp抑制效果最好,两个AcMNPV极早期基因iel启动子构成的双向结构质粒p402-Dielp-egfp也能很好的抑制gfp表达,而两个Hsp70启动子构成的双向结构质粒pBS-DHP-egfp效果最差,短发卡结构质粒和两个不同启动子构成的双向结构质粒的效果介于其间。
在利用RNAi干扰病毒基因表达方面,以各种表达dsRNA的质粒转染Sf9细胞12—24小时后,利用两种分别用多角体蛋白启动子(AcVL-GFP)和Hsp70启动子(B9F)表达gfp基因的重组杆状病毒感染细胞,结果表明,这些载体对AcVL-GFP中gfp表达影响不大;但在B9F中,p402-Dielp-gfp能明显抑制GFP的表达,pT-IH(hr5)一gfp效果次之,而pT-hr5-HP-Dgfp效果不显著。
利用Hsp70启动子和iel启动子,选择gp64基因中的两段分别构建了iel启动子和Hsp70双启动子反向结构质粒pT-IH(hr5)-gp64.1和pT-IH(hr5).gp64和正反义链独立的p402一sgp64和p402-asgp64、双iel启动子反向结构质粒p402-Dielp-gp64和p402-Dielp-gp64-1,经转染细胞后病毒感染,表明能够不同程度抑制病毒复制,使效价降低10倍左右。
本研究通过比较各种可产生dsRNA的载体,得到了若干能在昆虫细胞中有效地诱导RNAi作用的载体。这些结果对于深入研究杆状病毒,乃至昆虫细胞基因功能可能产生积极的影响。