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背景与目的遗传性牙龈纤维瘤病（hereditary gingival fibromatosis,HGF）是一种以牙龈纤维结缔组织弥漫性、渐进性增生为特点的罕见口腔遗传性疾病。主要表现为全口牙龈组织呈弥漫地渐进性增生,可累及全口游离缘、附着龈和牙龈乳头。增生肥厚的牙龈可覆盖部分或整个临床牙冠,牙齿常因增生的牙龈而发生移位,严重者可造成患者恒牙萌出异常、咀嚼受限、美观问题及心理负担。增生牙龈色泽正常,质地较韧,点彩明显。遗传方式以常染色体显性遗传为主,也有隐性遗传,国际上报道的发病率为1/175 000,无性别差异,而在国内尚未有发病率的统计。部分HGF可伴有其他多种系统性疾病而成为综合征型HGF。SOS1和REST基因是国际上较早报道的致病基因,但该致病基因在国内家系尚未得到验证,在今年我国学者首次发现了一个HGF新致病基因ZNF862,这表明HGF具有高度的遗传异质性。在前期工作中我们收集到一个明确诊断为非综合征型HGF包括19名患者共48人的大家系,并进行全基因组外显子测序技术（Whole Exome Sequencing,WES）排除了已报道的SOS1,REST和ZNF862基因;我们课题组在本研究中通过SNP芯片全基因组连锁分析将该家系的致病基因位点确定到了位于2号染色体上的一个区域,并结合全外显子测序和家系共分离鉴定到了一个新致病基因,暂命名为HGF相关基因（hereditary gingival fibromatosis related gene,HGFR）;本研究拟将进一步通过生物信息学分析、建立细胞模型等来深入研究HGF的新突变位点,明确非综合征型HGF疾病的致病基因,初步探究该新基因在非综合征型遗传性牙龈纤维瘤病致病机制中发挥的作用,进而为非综合征型HGF的分子发病机制提供新的遗传线索和新的理论依据。材料和方法1.对该非综合征型HGF家系进行家系调查、病史采集及标本收集;2.利用SNP芯片分析技术对该家系进行连锁分析来确定致病基因位点所在区域;3.通过全外显子测序技术（WES）和Sanger测序最终确定基因突变位点;4.生物信息学分析:利用PROVEAN软件进行突变蛋白的有害性分析预测,用Polyphen-2进行多物种间突变氨基酸的保守性预测分析;通过ExPAsy数据库预测分析突变前后蛋白质的理化性质变化;用SOPMA和Ⅰ-TASSER预测软件对该蛋白质分别进行二级结构及三级结构分析。5.体内RNA和蛋白质表达分析:切取家系患者和正常者牙龈组织提取RNA及进行免疫组化染色,对HGFR基因进行体内mRNA转录水平及蛋白质翻译水平分析。6.HGFR蛋白的亚细胞定位:将人类HGFR野生型（WT）和突变型（MUT）cDNA克隆到载体pEGFP-N1上,利用Lipofectamine 3000转染试剂转染到已培养好的HEK-293T细胞,转染48 h后,比较突变前后该蛋白质亚细胞定位的变化。7.构建人类HGFR野生型（WT）和突变型（MUT）pcDNA3.1-3xFlag过表达质粒,利用Lipofectamine 3000试剂转染到已培养好的人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts,HGF-1）中,转染 48 h 后,提取 RNA 和蛋白质,在体外进行该基因的mRNA表达水平和蛋白质表达水平分析。结果1.家系临床特征:该家系患者牙龈均呈广泛性弥漫性增生,可累及全口牙龈组织,达膜龈联合部;牙龈增生贯穿整个家系乳牙列、混合牙列及恒牙列,其中以后牙区的增生显著,增生的牙龈呈桑葚状或结节状,可覆盖2/3以上的牙冠,部分患者牙齿发生移位而出现牙列不齐,增生牙龈颜色呈粉红色,质地较为坚韧,可见明显点彩。2.确定突变位点:对该家系25名成员进行SNP芯片全基因组连锁分析,将致病基因候选阳性区域定位在2p23.3-2p24.1之间。结合患者（Ⅱ-6、Ⅳ-10）和健康对照（Ⅲ-6）的全外显子测序分析结果及家系共分离最终确定HGFR发生了错义突变,即 c.4154G＞T（p.W1385L）。3.生物信息学分析:PROVEAN预测结果表明该错义突变属于有害性突变,Polyphen-2表明该突变氨基酸位点在多种生物物种之间具有高度保守性;ExPAsy数据库预测突变后的蛋白质理化性质受到一定的影响;Ⅰ-TASSER预测软件表明该突变蛋白质的三级结构发生较大改变。4.体内实验结果表明家系患者牙龈组织中该基因的mRNA表达水平高于正常者（P＜0.01）,免疫组化结果显示家系患者蛋白质表达水平也相应升高（P＜0.01）。5.体外实验结果表明突变前后蛋白质的亚细胞定位尚未发生改变:均定位在细胞核和细胞质中;但与正常对照组相比,mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）。结论1.本课题组在豫东地区收集到的一个非综合征型HGF大家系中,通过SNP连锁分析将致病基因位点定位在2p23.3-2p24.1,该连锁区域与已报道的GINGF3亚型基因座贴近但不重合,是一个HGF新致病基因座。结合全外显子测序及家系共分离最终鉴定到一个HGFR基因的错义突变,即c.4154G＞T（p.W1385L）;2.生物信息学分析结果表明该c.4154G＞T（p.W1385L）属于有害性突变,且该突变位点在多物种间高度保守,同时蛋白质的三维空间结构也发生了明显变化;体内实验表明HGF患者的mRNA转录水平和蛋白翻译水平均高于对照组,体外实验显示,蛋白质的亚细胞定位没有产生变化,但mRNA水平高于对照组;这均表明该基因错义突变的致病性;3.HGFR基因c.4154G＞T（p.W1385L）错义突变扩展了非综合征型HGF的突变谱,为非综合征型HGF的致病分子机制研究提供了新的研究思路。