纳米材料由于具有极小的半径,而存在特殊的小尺寸效应、量子效应和巨大比表面积,从而产生了与常规物质完全不同的物理化学效应。树枝状大分子是一种新型的合成高分子纳米材料,在药物传递、医学成像和临床诊断方面有着重要意义。聚酰胺树枝状大分子纳米材料(PAMAM dendrimer)是一种具有高度分支化、呈辐射状对称的大分子。它由中心核、内层重复的分支亚单位以及表面的功能基团组成。整代的PAMAM纳米材料表面的功能基团为氨基,半代的PAMAM纳米材料表面的功能基团为羧基。整代的树枝状大分子PAMAM表面存在高密度的氨基,可与DNA等生物大分子结合并在空间上高度压缩,作为非病毒型载体将DNA和寡核苷酸等遗传物质或者治疗药物高效输送到细胞中。树枝状大分子本身也被用作研究药物,用于消除感染,抑制细胞、病毒、细菌等。可见,纳米材料在医学领域具有极大的应用前景。易于进入各种细胞是树枝状大分子区别于其他合成材料载体的独特优势,但同时也是其具有潜在风险的原因。因此,树枝状大分子的细胞相容性受到研究人员的格外关注。国外的研究人员研究了第3、5、7代PAMAM的体内外毒性、免疫原性及生物分布,结果显示纳米粒子的尺寸对其细胞毒性有明显的影响,但具体的作用机理还不清楚,需要进行后续研究。本实验室通过前期的研究,已经证实了PAMAM G3、G5的部分毒性作用机理。前期研究证实PAMAM G3可以导致细胞发生自噬性死亡,并通过自噬性死亡通路Akt-TSC2-mTOR引起小鼠的急性肺损伤。在前期的研究中还发现PAMAM G5可以致使血管紧张素2(Angiotensin Ⅱ)水平大大上升,血管紧张素转化酶2(ACE2)表达下降,从而导致肾素血管紧张素调节系统紊乱,导致肺动脉高压形成肺水肿,造成了急性肺损伤,而PAMAM G5导致的肝损伤则有不同的作用机理。总结上述研究,似乎不同代数的PAMAM纳米材料毒性作用机理完全不同,甚至同一种纳米材料针对不同的器官都有不同的毒性作用机理。因此,我们决定对PAMAM纳米材料进行更为深入和全面的研究。为进一步研究纳米材料PAMAM G7的毒性作用机理,我们利用肺组织病理、湿干比、肺弹性检测、血管渗透性检测等实验方法,首先证实了纳米材料PAMAMG7可以导致小鼠发生急性肺损伤；然后通过一系列体内外实验证实了PAMAM G7能够激活NF-κB细胞信号通路,并导致小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞因子水平明显升高；为进一步明确其上游通路,我们利用PI3K基因敲除小鼠进行检测,发现相对于野生型小鼠而言,PI3K基因敲除小鼠其肺损伤程度相对较轻,死亡率较低,BALF中的细胞因子水平也较低；从而明确了PI3K-NF-κB细胞信号通路是纳米材料PAMAM G7引起小鼠肺损伤的重要机制。为对纳米材料PAMAM的毒性作用进行更为全面的研究,我们对腹腔注射纳米材料PAMAM G4、G5的小鼠进行了全套血常规、血生化、血气分析,发现纳米材料PAMAM G4、G5可引起小鼠血小板减少症,并可能导致多器官功能损伤或衰竭。我们以PAMAM G5为例进行了更为深入的研究,证实小鼠在注射纳米材料PAMAMG5后可以引起DIC并伴有严重的出血倾向。进一步的病理以及相关实验结果显示腹腔注射纳米材料PAMAM G5的小鼠多个器官可能存在损伤或者衰竭,尤其以肺、肝等脏器损伤最为严重。在毒性作用机理的研究中,我们以PBMC作为研究对象,利用流式细胞术和荧光共聚焦显微镜检测发现纳米材料PAMAM G5可以激活TLR4受体,并通过体内外实验证明PAMAM G5可以激活NF-κB信号通路,因此我们得到初步结论,纳米材料PAMAM G5通过激活单核／巨噬细胞的TLR4-NF-κB信号通路,导致了前炎症因子的表达水平升高,从而引起血管渗透性增加,并进一步导致了组织炎症或损伤。在研究中我们还发现纳米材料PAMAM G5可以激活PBMC的ROS信号通路,这可能为PBMC中TLR4的激活提供了上游的分子基础。