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背景介绍:核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor, RI)是一种分子量约为50KDa的酸性糖蛋白,令人感兴趣的功能是其对血管生长因子(Angiogenin ,Ang)的紧密非共价结合引起的对血管生成的抑制效应。Ang在结肠癌细胞、肝癌细胞等均高于正常水平存在,在肿瘤的生长和转移过程中促进新生血管的生成。在此外RI还可能通过抑制碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)的表达等途径抑制血管生成。大量实验表明,新生血管的生成对于肿瘤的生长和转移是必须的;Folkman等学者认为,阻断肿瘤的血管形成就可以阻止肿瘤的生长,抗血管的生成的治疗可以有效地抑制肿瘤的生长并不伴有明显的副作用。这种治疗对多种实体肿瘤有独特的选择性并能减少耐药性的发生。RI与肿瘤抑制效果的关系,被许多实验确立。这样RI就成为一个有潜力的抗肿瘤的分子。然而在结构上,富含还原性的巯基以及大量的疏水结构,导致RI在生物体内血浆中的半衰期很短。通过基因治疗使RI在原位稳定地过表达可能是得以绕过这一障碍一个有效的方法。目前,基因治疗的导入系统可分为两类:病毒载体系统和非病毒载体系统。现在有相当多的基因治疗临床项目是采用前者中的逆转录病毒载体。本文所用的逆转录病毒载体pLNCX有来源于鼠莫氏白血病病毒和鼠莫氏肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)及巨细胞病毒即早启动子(PCMV)和一个新<WP=5>霉素筛选标记(neo)。该载体质粒一旦被转染入包装细胞系PA317即可被其表达的逆转录病毒外壳蛋白所包装,从而形成有感染力,却复制缺陷型的逆转录病毒颗粒。目的:研究逆转录病毒载体pLNCX介导人核糖核酸酶抑制因子( hRI )的基因治疗系统经静脉途径能否实现在肿瘤实验动物模型小鼠体内有效转染、表达,从而通过抗血管生成产生抗肿瘤效应,本实验还要检测该系统对小鼠血液和骨髓的安全性。方法:经包装细胞系PA317体外包装,携带hRI的cDNA序列的重组转录病毒载体经与NaCl和聚乙二醇6000(PEG6000)共沉淀并离心浓缩。再经Sepharose CL-4B凝胶层析纯化后,经过在NIH/3T3成纤维细胞系上的病毒滴度测定,以空载体及PBS缓冲液等为对照,经静脉注射给皮下接种B16黑色素瘤的C57BL/6J小鼠体内,以病理及免疫组织化学检测目的基因hRI在小鼠骨髓、肝脏和脾脏等体内各脏器的表达水平,肿瘤血管生成,观察hRI通过抗血管生成对黑色素瘤生长的抑制作用。以外周血细胞记数血液生化和骨髓染色体检测评价病毒载体对机体造血系统的影响。结果:转染的hRI基因产物在实验动物体内有效地表达,并对B16黑色素瘤表现出了抗血管生成效应,能抑制黑色素瘤的生长,同时不伴有明显的对造血系统的影响,同时我们发现hRI在肿瘤纤维包膜中的成纤维细胞有高表达。结论:介导hRI基因的逆转录病毒载体可以经静脉在小鼠体内转染通过抗血管生成实现对B16黑色素瘤的抑制。hRI在肿瘤纤维包膜中的成纤维细胞的高表达提示肿瘤发生时快速生长的成纤维细胞可以成为重要靶点。