凝血酶是重要的临床止血药,市场需求较大,应用前景广阔。但目前大部分企业生产的凝血酶产品杂质蛋白较多,内毒素含量较高,稳定性较差,临床事故时有发生。因此检测凝血酶产品中的杂质蛋白,研究去除凝血酶产品中内毒素的方法以及添加剂对凝血酶溶液稳定性的影响可为生产工艺优化、杂质蛋白去除,提高产品安全性与稳定性提供依据。本论文尝试通过BAPNA比色检测法和添加肝素后抗凝血酶Ⅲ明显抑制凝血酶活力的方法检测了凝血酶产品中的杂质蛋白。利用阴离子交换层析法和凝胶层析法进行了内毒素去除的研究。分别向凝血酶溶液中添加海藻糖、甘氨酸和葡萄糖等,筛选出了合适的凝血酶添加剂并优化了其与凝血酶的配合比例。主要研究结果如下:一、成功建立了凝血酶中α2-巨球蛋白的检测方法和抗凝血酶Ⅲ的检测方法,并证明α2-巨球蛋白的存在。通过对060401、060402、060403、060501、060502、060601、060602批次比活分别为68.9IU/mg、79.1IU/mg、130IU/mg、142.96IU/mg、339.69IU/mg、420IU/mg、476.66IU/mg的凝血酶样品的研究,证明了胰蛋白酶水解活力在反应开始后的40min左右保持稳定,水解产物的积累与时间成正比,形成线性关系。随着凝血酶比活的增大,其吸光值也逐渐减小,α2-巨球蛋白的活性从1.6逐渐降到0.2个活力单位,即凝血酶比活越大,产品的纯度越高,含有的杂质蛋白也越少,α2-巨球蛋白的活性越低。通过对060401、060402、060403、060501、060502、批次凝血酶的研究,相同浓度的对照组和添加肝素的实验组的凝血酶溶液初凝时间基本相同,说明了凝血酶中不存在抗凝血酶Ⅲ。实验表明,凝血酶产品中有α2-巨球蛋白杂质蛋白存在,而没有抗凝血酶Ⅲ存在。同时建立了一种凝血酶中α2-巨球蛋白的检测方法。二、利用层析方法有效去除了凝血酶产品中内毒素。利用离子交换层析和凝胶层析,对060401、060402、060403批次比活为68.9IU/mg、79.1IU/mg、130IU/mg凝血酶样品进行去除内毒素研究,层析前每单位凝血酶含内毒素都大于1.1726EU,层析后每单位凝血酶含内毒素都小于0.7313EU,利用凝胶过滤层析方法去除内毒素,其结果为层析后每单位凝血酶含内毒素小于0.9758EU。结果表明,离子交换层析及凝胶过滤层析能去除凝血酶产品的内毒素,且离子交换层析较为明显。三、添加剂提高了凝血酶产品稳定性。不同添加剂加入相同浓度的凝血酶溶液中,37℃、11d后加入甘氨酸的实验组酶活力保留30%,加入海藻糖的实验组保留18%,而对照组只保留15%,4℃、13d后加入甘氨酸的实验组酶活力保留68%,加入海藻糖的实验组酶活力保留55%,而对照组只保留48%。本实验证明甘氨酸、海藻糖均能提高凝血酶水溶液的稳定性,特别是甘氨酸:凝血酶=1:1000时,稳定性最好,具有较强的实际应用价值。