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禾本科植物的开颖是其进行有性繁殖的重要过程,而颖花开闭的调节是高效开展杂交育种和制种的关键限制因素之一,对农业生产具有重要的利用价值。禾本科植物的颖花开放由一对位于颖花基部的浆片吸水膨大启动,而细胞内水分的跨膜转运则通过膜上的水孔蛋白（AQPs）来实现。大麦（Hordeum vulgare L.）是世界上第四大谷类作物,但其绝大多数品种具有闭颖授粉特性,严重制约了大麦杂种优势的利用。因此,挖掘调控大麦开颖的关键基因对于促进大麦杂交育种意义重大。本研究以开颖大麦品种“沪1154”为材料,结合颖花开闭过程中的6个关键时期（S1-S6）浆片样品的转录组测序和基因家族分析结果,筛选获得响应颖花开闭的AQPs基因;随后利用多物种进化分析和绝对定量分析揭示了候选AQPs基因在进化历程和被子植物开花功能上的保守性;最后通过在水稻中异源表达验证进一步证明了候选AQPs基因在浆片膨大过程中的功能,为深入解析禾本科作物开闭颖的分子调控机制奠定了基础。主要研究结果分述如下:1.大麦开闭颖过程中浆片转录组分析本试验根据大麦开闭颖过程中6个关键时期,即大麦小花花药绿体期（S1）、花药黄体期（S2）、开颖起始花丝伸长至颖壳顶部（S3）、开颖角度最大花药外露（S4）、关颖一半花粉散尽（S5）和完全关颖（S6）,采集处于同一时期的浆片进行转录组分析。以S1时期作为对照,S2-S6时期共有3,636个上调的差异表达基因（DEGs）和1,711个下调的DEGs。上调的DEGs数量随着颖花开放过程呈增加趋势,从20个增加到599个。GO分析显示上调的DEGs显著富集在“碳水化合物代谢”、“转运”和“信号转导”等过程,涉及淀粉水解、细胞壁多糖代谢相关基因以及钙调素（CaM）和钙依赖性蛋白激酶（CDPK）等钙结合蛋白。“转运”相关的DEGs在S2-S6时期所有DEGs中占3.5%～17%,主要包括钾离子转运蛋白、糖转运蛋白和AQPs等。其中,AQPs基因在参与“转运”的DEGs中占6%-8%,表明这些AQPs基因在大麦开闭颖过程中浆片的膨大与收缩运动上可能具有重要作用。2.大麦HvAQP基因家族成员鉴定与时空表达谱分析本试验采用生物信息学方法对大麦全基因组内的AQP基因家族成员进行鉴定,并分析其染色体分布、系统发育、基因结构、蛋白序列相似度、启动子顺式调控元件、组织表达模式及其对颖花开放过程的响应。试验共鉴定到38个HvAQPs基因,随机分布在7条染色体上。系统发育分析表明,这些HvAQPs基因组成了 4个进化枝,对应PIPs、TIPs、NIPs和SIPs 4个亚家族。针对植物进化分枝上重要的42种陆生植物和藻类进行蛋白序列相似度分析发现,PIP亚家族成员序列在除藻类以外的大多数物种中高度保守,其次是TIP和NIP。基因结构分析显示,除两个SIPs成员含有NPL或NPT基序外,其他AQPs成员均含有NPA基序,且多数成员由3-5个外显子组成。启动子顺式作用元件分析结果表明,大多数AQPs成员含有发育相关、应激反应和激素反应的调控元件,如脱落酸响应、MYB与干旱诱导相关的结合位点和CGTCA-motif等结合元件。此外,利用转录组分析发现,在抽穗开花期,HvAQP家族有11个成员在大麦根、茎、叶、穗轴、颖片、花药、雌蕊和浆片等8个组织中均有表达,但它们的表达水平有所不同。HvTIP4;1、HvTIP4;2、HvPIP2;2、HvPIP2;8、HvLsi1 和 HvLsi6 在营养器官中表达量显著高于生殖器官;HvTIP1;2主要在颖片、叶片和浆片表达;而HvSIP2;1和HvTIP5;1在花药中表达量较高,由此可推测在大麦对复杂多变生存环境的适应过程中,HvAQPs的功能发生了明显分化。另外,在大麦颖花开闭颖过程中鉴定获得10个差异表达的HvAQPs基因,其中HvTIP1;1、HvTIP1;2、HvTIP2;3和HvPIP2;1不仅在浆片中大量表达而且响应整个开闭颖过程,因此被选取作为后续研究的候选HvAQPs基因。3.TIP1;1、TIP1;2、TIP2;3和PIP2;1多物种进化分析及其在被子植物开花过程中的功能验证基于OneKP数据库1,231个植物物种的系统发育分析显示,TIP1;1、TIP1;2、TIP2;3和PIP2;1蛋白在植物进化历程中,尤其是在被子植物中高度保守。因此,本试验分别选取3个单子叶（大麦、水稻、玉米）和双子叶（棉花、烟草、番茄）植物,对以上4个候选AQPs的同源基因在开花前（S1）和开花时（S4）的浆片或花瓣中的表达水平进行绝对定量分析,结果显示这4个AQPs基因在供试的6个物种中均显著响应开花过程,表明它们在被子植物的开花过程中具有较为保守的功能。亚细胞定位结果显示,HvTIP 1;1、HvTIP 1;2和HvTIP2;3位于液泡膜上,而HvPIP2;1则位于细胞膜上。利用pV1301-V5过表达载体对水稻品种Nipponbare进行遗传转化,获得4个大麦AQPs基因的水稻异源过表达株系。半定量和荧光定量PCR分析显示,4个大麦AQPs基因在过表达株系中的表达量显著高于野生型。通过对转基因株系和野生型材料在开颖前（S1）和开颖（S4）两个时期的浆片进行形态指标测定和统计分析发现,虽然在开颖前（S1）两者浆片的形态无显著差异,但在开颖（S4）时4个大麦AQPs基因过表达株系的浆片体积显著大于野生型植株,其中HvPIP2;1过表达效应最为突出,TIP亚家族3个成员中HvTIP1;2效果强于另外两个成员。以上结果表明,大麦HvTIP1;1、HvTIP1;2、HvTIP2;3和HvPIP2;1确实参与了开颖过程中浆片的膨大过程。