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Sox9基因是哺乳动物睾丸决定基因SRY的主要靶基因,位于雄性Y染色体上。在哺乳动物中,Sox9已被证明在雄性性别决定、睾丸发育和支持细胞分化等过程中发挥关键作用。支持细胞作为输精管内独特的体细胞,具有多种功能,包括为发育生殖细胞提供结构支持以及控制精原细胞的自我更新和存活。它们还产生不可渗透的免疫屏障,血睾屏障(BTB),并通过生精上皮细胞参与生殖细胞活动。本研究综合利用siRNA技术,实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR),流式细胞技术,EDU细胞增殖试验,CCK-8细胞增殖-毒性检测试验研究了干扰Sox9基因对猪未成熟支持细胞增殖、凋亡的作用,并分析了Sox9基因在猪睾丸组织不同发育时期的表达及免疫组化情况,研究结果如下:1、构建了3条Sox9 siRNA干扰序列,通过脂质体lip2000分别瞬时转染至猪未成熟支持细胞内,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测干扰后Sox9基因的表达量变化,结果显示干扰后Sox9基因表达明显降低(干扰效率为74%)。因此,可以继续进行后续实验;2、通过瞬时转染siSox9和siSox9NC后,利用流式细胞周期、CCK-8实验、EdU细胞增殖实验等观察细胞生长、增殖及凋亡的能力变化;并通过三种凋亡相关基因(Bax、Bcl-2、Caspase3)的qRT-PCR检测,确定Sox9基因在猪未成熟支持细胞中的生物学功能。流式细胞术检测细胞周期实验结果显示,处于G1期的细胞比例显著增加(P﹤0.01),而处于S期的细胞比例显著减少(P﹤0.01),表明细胞周期被阻滞在了G1期,说明干扰Sox9后会抑制未成熟支持细胞增殖、促进其凋亡;同时,CCK-8及EDU实验也同样表明干扰Sox9后会抑制未成熟支持细胞增殖、促进其凋亡;凋亡相关基因的qRT-PCR结果显示,干扰Sox9后,与促进凋亡相关的基因Bax和Caspase-3表达量上升,而与抑制凋亡相关的基因Bcl-2表达量下降,与western blot实验结果一致。以上结果都显示,干扰Sox9基因均能抑制猪未成熟支持细胞的增殖并促进其凋亡;3、对D1和D180的猪睾丸组织进行免疫组化实验分析表明:Sox9蛋白在D1阶段阳性表达水平较高,且多表达在支持细胞上;D180阶段蛋白阳性表达水平较低,少量支持细胞成免疫阳性反应;4、分析了D1、D30、D60、D90、D120、D150六个阶段猪睾丸组织中Sox9基因m RNA表达量变化,实验结果表明Sox9 mRNA整体表达水平呈现先升高后降低的趋势,在D30时表达最高,之后表达量呈现稳步下降趋势;综上所述,干扰Sox9基因会抑制猪未成熟支持细胞的增殖并促进其凋亡,并且研究表明Sox9基因主要作用在猪早期未成熟支持细胞上。