目的：　　 获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的一种严重传染病。目前由于没有有效预防HIV感染的疫苗和根治的药物,艾滋病仍然是无法攻克的难题。研究表明,在HIV感染过程中,免疫系统一方面受到病毒感染的损害,另一方面发挥抗病毒的功能,抑制病毒复制。自然杀伤细胞(natural killercell,NK)是天然免疫系统中的重要效应细胞,在控制肿瘤和微生物感染中发挥重要作用。目前,关于HIV慢性感染者NK细胞功能变化的研究结果不尽相同。另外,关于HIV原发感染者(primary HIV infection,PHI)和长期不进展者(Longterm non-progressor,LTNP)NK细胞功能的变化还鲜有报道。我国人群的NK细胞数量和亚群分布与欧美国家人群不同,因此对我国HIV感染者NK细胞功能的研究非常重要。NK细胞作为机体抗肿瘤和感染的第一道防线,在获得性免疫应答之前就发挥免疫作用来保护机体,同时也是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁,因此研究NK细胞功能在HIV疾病进展中的变化具有重要的科学意义。本研究应用多色流式细胞分析技术,选择interferon-γ(IFN-γ)、CD107a,和颗粒酶B对HIV感染者NK细胞分泌抗病毒细胞因子IFN-γ功能以及细胞毒性功能进行研究。　　 方法：　　 1、研究对象　　 选取未接受过抗病毒治疗的HIV感染者,按感染时间不同选取HIV原发感染组(PHI组)10例、HIV慢性感染组(CHI组)18例。按疾病进展不同选取分为长期不进展组(LTNP组)13例及典型进展组(TP组)18例。健康对照组(NC组)为13例随机抽取的HIV抗体阴性、未暴露于HIV的健康人,性别、年龄均与HIV感染者匹配。　　 2、CD4+T细胞绝对值的检测　　 将20μl BD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP试剂加入绝对计数管中,逆向加样法加入50μl混匀的抗凝全血,室温避光15min,加入1×免洗溶血素450μl,室温避光15min,应用FACS Calibur流式细胞仪进行检测,MultiSET软件分析结果,得到CD4+T淋巴细胞的绝对值。　　 3、NK细胞功能实验　　 复苏冻存的人外周血单个核细胞,孵育过夜。与缺乏MHC-Ⅰ类分子的K562细胞系(E:T为5:1)共孵育,同时加入抗CD107a抗体和GolgiStop,共同孵育6小时。用抗体组合CD3-Percp/CD56-Pe-cy7(美国BD公司)进行表面染色。使用BD Cytofix/CytopermTM Fixation/Permeabilization Kit(美国BD公司)进行破膜10分钟,胞内染色IFN-γ-FITC,granzymeB-FITC(美国BD公司),4℃,30分钟。用1％多聚甲醛固定。　　 4、HIV病毒载量测定　　 采用Roche公司COBAS(R)AmpliPrep(R)/COBAS(R)TaqMan(R)HIV-1 Test试剂盒在Roche COBAS(R)AmpliPrp(R)上提取核酸后转移到COBAS(R)TaqMan(R)系统进行全自动PCR反应体系制备及病毒载量检测。　　 5、统计学分析　　 应用SPSS11.5软件包进行统计分析,所有数据以中位数表示,两组间实验指标的比较采用Mann-Whitney U检验,相关性分析采用Spearman秩相关检验,P≤0.05为有统计学意义。　　 结果：　　 一、HIV原发感染者和慢性感染者NK细胞功能的变化　　 1、HIV原发感染者和慢性感染者NK细胞及亚群构成情况　　 HIV慢性感染者NK细胞百分比显著低于健康对照组(P=0.034),而HIV原发感染者CD3-CD56dimNK细胞的百分比高于健康对照组和慢性感染者(P=0.014,P=0.015),CD3-CD56brightNK细胞百分比各组间无显著差异。　　 2、NK细胞分泌IFN-γ功能的变化　　 各组产生IFN-γ的CD3-CD56+NK细胞百分比没有显著差异。原发感染者CD3-CD56dimNK细胞亚群分泌IFN-γ的百分比显著低于HIV慢性感染者(P=0.017)。HIV慢性感染者CD3-CD56brightNK细胞亚群分泌IFN-γ的百分比高于健康对照者(P=0.027)。　　 3、CD107a在NK细胞表面表达的变化　　 HIV慢性感染者CD3-CD56+NK细胞及CD3-CD56dim亚群CD107a表达水平高于健康对照组(P=0.033,P=0.034)。HIV原发感染者CD3-CD56brightNK细胞亚群表达CD107a水平高于慢性感染者和健康对照组(P=0.003,P＜0.001)。　　 4、NK细胞颗粒酶B释放情况比较　　 我们的实验结果发现HIV慢性感染者NK细胞颗粒酶B释放的百分比显著高于健康对照组(P=0.026)。CD56dimNK亚群和CD56bright亚群颗粒酶B各组间无明显差异。　　 二、HIV感染长期不进展者NK细胞及各亚群功能特点　　 1、HIV感染长期不进展者NK细胞及各亚群构成情况　　 结果显示:HIV感染长期不进展者和典型进展者CD3-CD56+NK细胞百分比显著低于健康对照组(P=0.001,P+0.034)。在CD3-CD56dim亚群和CD3-CD56bright亚群,各组间无明显差异。　　 2、HIV感染长期不进展者NK细胞及各亚群分泌IFN-γ功能特点　　 实验结果发现长期不进展者CD3-CD56+NK细胞分泌IFN-γ的水平较健康对照组高(P=0.034)’,在CD3-CD56dim亚群也发现相同的结果(P=0.028)。典型进展者和长期不进展者CD56bright亚群的IFN-γ产生水平较健康对照组高(P=0.026,P=0.032),　　 3、HIV感染长期不进展者NK细胞及各亚群表达CD107a功能特点　　 结果发现长期不进展者CD3-CDS6+NK细胞表达CD107a水平较健康对照组高(P=0.045),在CD3-CD56dimNK细胞亚群也有相同的结果(P=0.037)。而CD3-CD56bright亚群典型进展者高于健康对照组和长期不进展者(P=0.012,P=0.024)。　　 4、HIV感染长期不进展者NK细胞及各亚群颗粒酶B释放功能特点　　 我们的实验结果发现长期不进展者CD3-CD56+NK细胞颗粒酶B释放百分比高于典型进展者和健康对照组(P=0.028,P=0.004),在CD3-CD56dim亚群也看到相同的结果(P=0.028,P=0.003),而CD3-CD56brightNK细胞亚群各组间无明显差异。　　 三、HIV感染者NK细胞功能与病毒载量、CD4+T细胞计数的相关性　　 1、HIV感染者NK细胞功能与病毒载量的相关性　　 实验结果表明,HIV感染者IFN-γ+NK细胞百分比与病毒载量呈显著负相关(r=0.382,P=0.015)。在CD3-CD56dimNK细胞亚群,IFN-γ分泌量与病毒载量呈负相关(r=-0.320,P=0,044)。HIV感染者CD107a+NK细胞百分比与病毒载量无显著相关性。　　 2、HIV感染者NK细咆功能与CD4+T细胞计数的相关性　　 实验结果发现,NK细胞及各亚群分泌IFN-γ的功能和CD107a的表达与CD4+T细胞计数无显著相关性。　　 结论：　　 1、HIV慢性感染者NK细胞分泌抗病毒细胞因子IFN-γ的功能和细胞毒性功能活跃,提示NK细胞在HIV感染进入慢性感染阶段后仍然发挥抗病毒功能。　　 2、长期不进展者NK细胞分泌抗病毒细胞因子IFN-γ的功能和细胞毒性功能增强,其杀伤功能高于典型进展者提示NK细胞功能增强是控制HIV感染疾病进展的保护性因素。　　 3、HIV感染者NK细胞产生IFN-γ的水平与病毒载量呈显著负相关,提示NK细胞功能增强与延缓HIV感染疾病进展相关。