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原发性肝癌是亚洲国家常见的消化道恶性肿瘤之一,在中国其病死率占恶性肿瘤的第二位,仅次于胃癌。近年来,我国肝癌的发病率呈逐年上升的趋势。肝癌恶性程度高,术后复发、转移率高,患者预后差,术后5年生存率为36-50%。与其他恶性肿瘤一样,复发和转移是影响患者预后的主要因素。肝癌的复发和转移过程涉及基因及蛋白层面众多肿瘤相关因子的异常表达及功能改变,对这些异质性的分子事件进行深入研究是发现新的肿瘤治疗手段及治疗靶点的重要方法。microRNA是一类小分子非编码RNA,长约18-25核苷酸。miRNA通过与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’-UTR)结合引起mRNA降解或蛋白翻译抑制,在转录后或翻译水平调节基因表达。microRNA与肿瘤关系密切,肿瘤中miRNA表达谱异常表明这类具有调节作用的小RNA分子参与癌症生物学过程。作为致癌miRNA, miR-21在许多人类恶性肿瘤中均呈明显高表达,参与肿瘤增殖、凋亡、侵袭和转移等恶性进程。抑癌基因PDCD4是miR-21具有重要生物学功能的靶基因之一。虽然目前已有研究报道miR-21及PDCD4在其他肿瘤中的表达及作用,但是miR-21在肝癌迁移侵袭中的生物学功能及其调控机制尚不明确。本文拟开展miR-21在肝癌中的实验研究,由“miR-21在恶性肿瘤中的表达水平明显上调”这一现象,我们提出miR-21在肝癌中是否作为一种类似原癌基因而存在?是否是一个潜在的肿瘤治疗靶点?由此,我们设计实验研究如下：1.研究肝癌组织和不同侵袭潜能细胞中的miR-21及PDCD4的表达特点,分析两者的表达水平与肿瘤侵袭转移之间的关系。2.研究调节miR-21及PDCD4表达对肝癌细胞迁移、侵袭能力及下游信号通路分子表达的影响,探讨miR-21-PDCD4轴调节肿瘤迁移侵袭的分子机制。第一章miR-21和PDCD4在肝癌组织以及细胞中的表达和意义目的研究miR-21和PDCD4在肝癌组织和不同侵袭潜能细胞中的表达特点方法抽提组织及细胞总RNA和蛋白质,分别采用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR)和Western blot检测miR-21及PDCD4蛋白在肝癌组织及癌旁正常肝组织、人正常肝细胞系(L02)及四种不同侵袭潜能的肝癌细胞系(HepG2、Bel-7402、MHCC97-H、Huh-7)中的表达,并分析二者与肝癌临床病理特征之间的关系。结果1.miR-21在肝癌组织中的表达显著高于癌旁正常肝组织,且在转移组及Ⅲ-Ⅳ期患者中的表达明显升高；四种肝癌细胞(HepG2、Bel-7402、MHCC97-H、 Huh-7)中miR-21的表达显著高于正常肝细胞系L-02,并且随着肿瘤细胞侵袭能力的增加,miR-21的表达渐次增加(MHCC97-H>Bel-7402>HepG2>Huh-7)、2. PDCD4蛋白在肝癌组织中的表达显著低于癌旁正常肝组织,且在转移组及Ⅲ-Ⅳ期患者中的表达明显降低；四种肝癌细胞(HepG2、Bel-7402、MHCC97-H、 Huh-7)中PDCD4蛋白的表达显著低于正常肝细胞系L-02,并且随着肿瘤细胞侵袭能力的增加,PDCD4的表达逐渐降低。3. miRNA-21与PDCD4蛋白在肝癌组织及细胞中的表达呈显著负相关结论1.miR-21在肝癌组织及细胞中的表达显著升高,在转移组及Ⅲ-Ⅳ期患者中表达亦明显升高,并且随着细胞侵袭能力的增强而增高。2. PDCD4蛋白在肝癌组织及细胞中的表达显著降低,在转移组及Ⅲ-Ⅳ期患者中表达亦明显降低,并且随着细胞侵袭能力的增强而降低。3.miR-21表达与PDCD4蛋白表达水平在肝癌组织及细胞中呈显著负相关。4. HepG2细胞中miR-21及PDCD4蛋白的表达均处于中等水平,且易于转染,选择HepG2细胞进行后续实验。第二章miR-21-PDCD4-AP-1反馈环路参与调节肝癌细胞侵袭和转移目的研究调节miR-21及PDCD4表达对肝癌细胞HepG2迁移、侵袭能力及相关下游信号通路分子表达的影响,探讨miR-21-PDCD4-AP-1反馈环路参与肝癌侵袭转移的分子机制。方法1.首先研究正向调控通路,实验分为单独转染(空白对照组、阴性对照组、miR-21inhibitor组、PDCD4siRNA组)、共同转染(inhibitor阴性对照组+siRNA阴性对照组、miR-21inhibitor+siRNA阴性对照组、miR-21inhibitor+PDCD4siRNA组)(1)化学合成miR-21inhibitor、PDCD4siRNA及相应阴性对照(2) Transwell迁移实验检测各组细胞的迁移能力,评价miR-21、PDCD4对HepG2细胞的迁移能力的影响,并分析PDCD4在这过程中的重要性。(3) Transwell侵袭实验检测各组细胞的侵袭能力,评价miR-21、PDCD4对HepG2细胞的侵袭能力的影响,并分析PDCD4在这过程中的重要性。(4)分别应用Western blot及real time PCR检测各组细胞中PDCD4及其下游调控因子(c-Jun、p-c-Jun、MMP-2、MMP-9)蛋白和mRNA的变化2.然后研究反向调控通路,实验分为空白对照组、阴性对照组、c-Jun siRNA组,应用real time PCR检测各组细胞中miR-21表达水平的变化结果1.单独转染条件下：(1) Transwell迁移实验中各组迁移细胞数为：空白对照组,(75.3±2.5)/HP；阴性对照组,(71.3+2.1)/HP; miR-21inhibitor组,(39.7+2.5)/HP; PDCD4siRNA组,(101+4.0)/HP。miR-21inhibitor组迁移细胞数显著低于对照组(P<0.05),PDCD4siRNA组迁移细胞数显著高于对照组(P<0.05),两对照组间迁移细胞数无明显差异(P>0.05)。(2) Transwell侵袭实验中各组侵袭细胞数为：空白对照组,(58.3±1.5)/HP；阴性对照组,(56.7+2.1)/HP; miR-21inhibitor组,(33.7+2.5)/HP; PDCD4siRNA组,(73+3.6)/HP。miR-21inhibitor组侵袭细胞数显著低于对照组(P<0.05),PDCD4siRNA组侵袭细胞数显著高于对照组(P<0.05),两对照组间迁移细胞数无明显差异(P>0.05)。(3) PDCD4mRNA在miR-21inhibitor组中的表达较空白对照组及阴性对照组分别增加了(3.0±0.11)倍及(2.9±0.06)倍(P<0.05)；PDCD4蛋白在miR-21inhibitor组中的表达较空白对照组及阴性对照组分别增加了(1.3±0.03)倍及(1.2±0.04)倍,两对照组间均无明显差异(P>0.05)。(4) p-c-Jun蛋白在miR-21inhibitor组中的表达较空白对照组及阴性对照组分别下降了(72.7±1.13)%及(70.1±2.11)%(P<0.05),两对照组间无明显差异(P>0.05)。;c-Jun蛋白在空白对照、阴性对照、miR-21inhibitor三组细胞中的表达无显著性差异(P>0.05)。(5)与空白对照组及阴性对照组相比,MMP-2mRNA在miR-21inhibitor组中的表达分别下降了(58.3±3.32)%及(51.9+3.91)%(P<0.05), MMP-9mRNA的表达则分别下降了(68.3±4.17)%及(62.7±2.42)%(P<0.05),两对照组间均无明显差异(P>0.05)。(6)与空白对照组及阴性对照组相比,p-c-Jun蛋白在PDCD4siRNA组中的表达分别增加了(81.0±3.05)%及(85.1±5.4)%(P<0.05),而c-Jun蛋白在三组细胞中的表达无显著性差异(P>0.05)；MMP-2mRNA在PDCD4siRNA组中的表达分别增加了(47.5+4.69)%及(53.8+4.33)%(P<0.05),MMP-9mRNA的表达则分别增加了(68.5+5.41)%及(74.1±3.92)%(P<0.05)；空白对照组与阴性对照组间均无明显差异(P>0.05)。2.共同转染条件下：(1) Transwell迁移试验中(miR-21inhibitor+PDCD4siRNA)组细胞迁移至膜背面的细胞数明显多于(miR-21inhibitor+siRNA阴性对照)组[(83.7+3.1)/HP vs (57.8±3.4)/HP](P<0.05);同样在侵袭实验中,两组之间亦有显著性差异。(2)与(miR-21inhibitor+siRNA阴性对照)组相比,p-c-Jun蛋白在(miR-21inhibitor+PDCD4siRNA)组的表达增加了(112.7±1.8)%(P<0.05), MMP-2、MMP-9mRNA在(miR-21inhibitor+PDCD4siRNA)组的表达分别增加了(40.4+2.6)%、(36.3±4.8)%(P<0.05),而c-Jun蛋白在两组之间无明显差异(P>0.05)。3.miR-21在c-Jun siRNA组中的表达较空白对照组及阴性对照组分别减少了(19.8±1.61)%及(17.3±1.54)%(P<0.05),两对照组间无显著差异(P>0.05)。结论1.体外细胞实验中,外源性低表达miR-21可有效抑制肝癌细胞HepG2迁移及侵袭能力。而降低PDCD4表达对肝癌细胞HepG2迁移及侵袭能力有显著的促进作用。2.miR-21在转录及翻译水平抑制靶基因PDCD4的表达,增加下游调控因子c-Jun磷酸化及AP-1活性,上调侵袭相关蛋白酶MMPs转录表达,并且PDCD4在miR-21介导的肝癌侵袭转移中不可或缺。3.肝癌细胞HepG2中转录因子AP-1可以激活miR-21转录。4.miR-21可作为转录因子AP-1的靶目标和调节器,miR-21-PDCD4-AP-1正反馈环路起着维持miR-21生物学作用及肝癌细胞的恶性表型的作用,该环路为阻止HCC的侵袭、转移提供新的治疗策略。