细胞凋亡是机体生命活动中重要的细胞学事件,在许多疾病的治疗中也起着关键性作用。光动力学疗法(PDT)是一种治疗癌症的新的技术,由它所引起细胞的死亡多以凋亡的形式发生,但由PDT引起的细胞的凋亡机制及其内部的调节过程都很复杂。本论文在充分调研国际、国内有关PDT凋亡研究的历史和进展的前提下,将FRET技术和化学发光探针运用到PDT凋亡机理的研究,得到了初步但非常有意义的结果,证明这两种方法在凋亡机理研究中的可行性。 本文首先概述了有关光动力疗法的基本知识以及治疗肿瘤的机制,总结了细胞凋亡相关蛋白的基本信息以及与细胞凋亡通路的调节,并对FRET技术的基本原理以及在蛋白相互作用的应用情况做了简要的描述。 本论文分三个部分详细介绍了实验工作: 在第一部分的实验工作中,运用荧光共振能量转移(FRET)成像技术监测在肿瘤坏死因子(TNF-α)和光动力作用诱导凋亡过程中细胞内caspase-3的活性,并对在凋亡前后细胞内稳定表达的荧光蛋白发射光谱的改变及FRET探针稳定表达后在细胞内的分布情况进行了研究。实验结果显示:FRET探针稳定表达后在细胞中细胞核和细胞质中均有分布;且细胞在凋亡前后的荧光发射光谱有明显的变化,而PDT作用时的照射激光对探针的FRET效率并无影响。对细胞进行FRET成像分析发现:未经任何处理的荧光细胞中CFP和YFP的荧光强度无明显的改变:经TNF-α或PDT处理的细胞,荧光蛋白CFP/YFP的比率有明显的增加。荧光探针的CFP/YFP的上升反应了细胞内caspase 3活性的增强,说明不论是TNF-α还是PDT处理的细胞内,caspase-3的活性都有增强。因此,通过FRET探针成像的检测技术,可以在活细胞水平实时监测PDT过程中细胞内caspase 3活性改变以及凋亡的启动。 在第二部分的实验工作中,为研究Photofrin-PDT所引起的细胞凋亡的凋亡通路,对Photofrin的定位、caspase-8的活性及caspase-3活化的动力学过程进行检测。结果发现Photofrin结合到线粒体膜上,由于光敏作用导致的损伤主要发生在光敏剂结合位点附近几个纳米的范围内,因此线粒体为Photofrin-PDT诱导的凋亡的最初作用靶点。Photofrin-PDT处理后,caspase-8未被激活,它所诱导的