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流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)是由流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一种蚊媒性人兽共患病。JEV可感染人与多种动物,主要的传播媒介为三带喙库蚊,通过蚊虫的叮咬在宿主之间传播,水鸟和猪为主要的扩大宿主,人为终末宿主。目前流行性乙型脑炎仍没有有效的治疗方法,以预防为主,主要是通过接种疫苗进行预防。虽然流行性乙型脑炎目前已得到有效的控制,但对于流行性乙型脑炎病毒的复制周期的研究仍有许多空白,对于宿主因子在病毒复制周期中的不同阶段发挥的作用仍不清楚。Sec62/Sec63复合体由Sec62蛋白和Sec63蛋白组成,为内质网上的跨膜蛋白,主要功能是与参与某些蛋白的新生前体多肽向内质网的Sec61通道中的转运过程。Sec62可以与核糖体相互作用,参与蛋白质的翻译,影响内质网中蛋白质的易位过程,可以引起内质网应激。Sec63蛋白由3个跨膜结构域组成,内质网内J结构域与分子伴侣(Binding Protein,Bip)相互作用,促进前体蛋白通过Sec61通道进行易位。为研究Sec62/Sec63复合物对JEV复制的影响,本研究应用CRISPR/Cas9技术分别构建SEC62、SEC63基因敲除的HEK-293细胞系,分别命名为SEC62 KO HEK-293细胞与SEC63 KO HEK-293细胞。分别以MOI为1、0.05的JEV感染HEK-293、SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞后,利用间接免疫荧光试验检测Sec62/Sec63复合物对JEV复制的影响,结果显示不同剂量JEV感染SEC62 KO HEK-293细胞与SEC63 KO HEK-293细胞中荧光信号阳性细胞均少于HEK-293细胞对照组;以MOI为1的JEV感染HEK-293、SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞后,经western blot检测结果显示于感染后12h、24h和48h SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞中均未能检测出JEV E蛋白条带,而对照HEK-293细胞中JEV E蛋白的表达逐渐增加。分别以MOI为1、0.5、0.05的JEV感染上述三种细胞后检测细胞培养液中病毒滴度,结果显示JEV感染12h后SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞与HEK-293细胞组病毒滴度无明显差异(p>0.05),而在感染后24h与48h时,SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞与HEK-293细胞组病毒滴度差异极显著,SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞培养液中病毒滴度均显著低于HEK-293细胞对照组(p<0.01)。以上结果表明SEC62、SEC63基因敲除后均抑制了JEV的复制,也表明Sec62、Sec63是影响JEV在细胞内复制的重要宿主因子。本研究为进一步探究Sec62、Sec63等宿主因子对JEV复制的影响机制提供了参考依据。