【摘 要】
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近年来细菌耐药问题日趋严重,已成为公共健康领域的一项重大挑战。金黄色葡萄球菌作为主要的食源性致病菌之一,引发的食物中毒事件得到了广泛关注。随着抗生素的滥用,导致越来越多的耐药菌株产生,基因的水平转移（Horizontal gene transfer,HGT）是也细菌获得耐药的主要方式之一。成簇的规律间隔短回文重复序列（Clusters regularly interspaced short pal
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近年来细菌耐药问题日趋严重,已成为公共健康领域的一项重大挑战。金黄色葡萄球菌作为主要的食源性致病菌之一,引发的食物中毒事件得到了广泛关注。随着抗生素的滥用,导致越来越多的耐药菌株产生,基因的水平转移（Horizontal gene transfer,HGT）是也细菌获得耐药的主要方式之一。成簇的规律间隔短回文重复序列（Clusters regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs）与其相关的基因序列（CRISPR-associated,cas）编码的Cas蛋白组成的CRIPSR/Cas,可以影响HGT。目前对于CRISPR/Cas系统与细菌耐药性的关系研究并不明确,因此本研究以食源性金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas作为研究对象,筛选100株不同食物源分离出的金黄色葡萄球菌耐药情况及相关耐药基因的携带率,并检测肠毒素基因的分布状况;检测金黄色葡萄球菌CRISPR阳性率,比较CRISPR阳性和阴性菌株的耐药差异;其次采用生物信息学法对金黄色葡萄球菌CRISPR系统研究,并通过抗生素诱导获得耐药菌株,对耐药菌株和野生菌株进行CRISPR/Cas系统的比对分析,cas m RNA表达水平的差异和CAS蛋白表达水平差异进行比对,为进一步研究CRISPR/Cas功能与耐药性关系研究奠定础。主要研究内容结果如下:（1）100株金黄色葡萄球菌中氨苄西林的耐药性最高,耐药率为76%;其次对青霉素和卡那霉素的耐药率也较高,分别为68%和65%,氯霉素耐药率为17%,多重耐药率高达58%。从鸡肉（32份）和米面制品（27份）中分离出的金黄色葡萄球菌耐药率最高,分别为71.87%和74.07%。肠毒素检出率高达78%。（2）从CRISPR Database数据库中筛选出83株金黄色葡萄球菌具有CRISPR 4级位点信息。进行研究的24组重复序列均能形成较为保守的哑铃状RNA二级结构。对43组间隔序列分析,来自两个菌株的11个间隔序列与外源噬菌体、质粒保持高度同源性。MLST分型结果表明83株金黄色葡萄球菌分别属于25个不同的ST型别,25种ST型别可以分到5个CC种,其中CC5占比最高。对83株金葡菌的肠毒素基因进行统计,结果显示这83株具有CRISPR系统的金黄色葡萄球菌对5种经典型肠毒基因携带率为6%。（3）对现有的100株菌株进行CRISPR结构筛选:CRISPR1的携带率为7%,CRISPR2的携带率为4%,cas1 cas2基因的携带率为5%。筛选出一株具有完整CRISPR/Cas系统的菌株。经环丙沙星,四环素诱导耐药后对不同抗生素敏感度产生了变化,根据测序比对结果可以发现cas1,cas2基因诱导前后没有变化;传代80代菌株cas6基因发生部分缺失,四环素、环丙沙星诱导耐药的菌株cas6基因部分碱基位点突变。环丙沙星诱导的菌株和传代80代菌株cas10基因部分丢失。四环素、环丙沙星诱导耐药后的菌株cas1、cas6、cas10、csm2、csm3、csm4、csm5 csm6基因转录水平有不同程度的降低,仅有cas2基因转录水平提高。传代80代后的菌株大部分cas基因转录水平提高。本研究通过筛选100株金黄色葡萄球菌的耐药性、肠毒素基因和CRISPR系统的携带率,对CRISPR重复序列和间隔序列进行生物信息学分析,并且从cas基因m RNA表达水平和CAS蛋白表达水平,探讨CRISPR序列与耐药性的关系。为深入研究金黄色葡萄球菌的耐药性、毒力性等机制奠定基础。
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