研究背景及目的：肿瘤细胞对化疗药物产生原发和继发耐药是肿瘤有效治疗的主要障碍。多种机制参与肿瘤细胞耐药性的形成，包括药物作用靶点的改变，DNA损伤后修复能力增强，肿瘤细胞凋亡逃避，细胞周期检测点改变，化疗药物代谢酶诱导性活性增强或表达升高以及肿瘤细胞对化疗药物的摄取减少主动外排增加等。其中ATP结合盒膜通道转运蛋白(ATP—bindingcassette(ABC)transporters)能量依赖性将结构和作用机制不同的抗肿瘤药物外排到肿瘤细胞外是产生多药耐药性(multidrugresistance，MDR)的主要原因。在人类基因中，目前发现它共有48个成员，依据它们序列的相似性被分为7大类，从ABCA至ABCG。在这个家族中，与肿瘤MDR关系最为密切的是P—糖蛋白(P—glycoprotein，P—gp/MDR1/ABCB1)、多药耐药性相关蛋白(multidrugresistanceassociated—proteins，MRPs/ABCCs)和乳腺癌耐药蛋白(breastcancerresistanceproteinBCRP/ABCG2/MXR)。ABCB1由12个跨膜结构域和2个ATP结合盒组成，ABCC1和ABCB1结构相似，但在N—末端还包含5个跨膜结构域，而ABCG2则只包含6个跨膜结构域和1个位于N—末端的ATP结合盒，属于半转运体。这些ABCtransporters在肿瘤细胞膜过度表达时会结合抗癌药物，同时其ATP结合位点结合ATP，ATP水解释放能量促使药物被泵到胞外，使细胞内药物浓度始终维持在较低水平，肿瘤细胞从而获得耐药性。目前研究最为深入的是ABCB1介导的MDR。 理论上克服MDR有多种方法：如开发对肿瘤MDR细胞不具抗药性的新型抗癌药物；寻找高效、低毒对抗癌药物药代动力学无影响的MDR逆转剂与抗癌药物合用，恢复MDR肿瘤细胞对抗癌药物敏感性；降低耐药蛋白表达等。 第一代逆转剂如环孢素A和维拉帕米由于自身毒副作用限制了其进一步的研究，第二代逆转剂如valspodar(PSC833)和biricodar(VX-710)尽管毒性减少，但由于会干扰联合应用抗肿瘤药物的药代动力学产生不可预测的毒副作用而限制了进一步的应用。尽管到目前为止真正能够用于临床的逆转剂尚未开发成功，但根据定量结构-活性关系(quantitativestructure-activityrelationships，QSARs)和组合化学方法所开发的具有高特异性逆转作用的第三代逆转剂如LY335979，ONT-093，R101933，GF120918以及XR9576等在与抗癌药物合用时很少干扰后者的药代动力学，这也让研究者们看到了最终克服MDR的曙光。 酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors，TKIs)通过与ATP竞争性结合到酪氨酸激酶催化区域ATP结合位点从而阻断酪氨酸激酶磷酸化后下游信号的激活，进而使细胞周期阻滞，抑制肿瘤血管生成，阻断肿瘤细胞的浸润和远处转移，诱导肿瘤细胞凋亡；体外生物化学及细胞评价方法发现TKIs可以调节ABCtransporters的功能。 本研究对多芳基取代咪唑类化合物FG020326的逆转机制，酪氨酸激酶抑制剂lapatinib和sunitinib与ABCtransporters的关系进行了研究。 研究方法：细胞毒测定用MTT法；以KBv200细胞建立裸鼠移植瘤模型探讨FG020326和lapatinib体内逆转活性；蛋白测定用Westernblotting；ABCB1和ABCG2在mRNA表达水平用RT-PCR法测定；RNA干扰法观察沉默Erk后对KBv200细胞存活的影响；阿霉素，罗丹明123积累以流式细胞仪测定；高压氮气破裂法制备细胞膜泡并用快速滤膜过滤法进行膜泡药物输送实验测定lapatinib和sunitinib对ABCB1和ABCG2介导药物转运的影响；钒敏感法测定FG020326对ABCB1ATPase活性，lapatinib对ABCB1和ABCG2ATPase活性的影响；[125I]-Iodoarylazidoprazosin(IAAP)和[3H]azidopine光亲和标记实验探讨lapatinib与ABCB1和ABCG2的作用位点以及FG020326与ABCB1作用位点情况；药代动力学测定用HPLC法；超速离心法制备人肝微粒体并用HPLC法测定FG020326或lapatinib对CYP3A4活性的影响。 结果: 1.以ABCB1高表达细胞MCF—7/Adr和KBv200及相应亲本敏感细胞株MCF—7和KB，ABCC1高表达细胞KB—CV60及亲本敏感细胞KB—3-1，ABCC4高表达细胞NIH3T3/MRP4-2及亲本敏感细胞NIH3T3，ABCG2高表达细胞S1-M1-80及敏感细胞S1，LRP高表达细胞SW1573/2R120和敏感细胞SW1573为模型，体外评价FG020326逆转活性。FG020326浓度依赖性地增加ABCB1底物紫杉醇，阿霉素和长春新碱对MDR细胞MCF—7/Adr和KBv200的细胞毒作用，而对非ABCB1底物顺铂和5-FU的细胞毒作用则无明显影响；FG020326浓度依赖性地增加阿霉素和罗丹明123在MDR细胞中积累，但不影响阿霉素和罗丹明123在相应敏感细胞中积累，同时显著抑制ABCB1对阿霉素的外排，说明FG020326通过抑制ABCB1药物外排泵功能恢复MDR细胞对化疗药物的敏感性。 FG020326浓度依赖性地抑制[3H]azidopine对ABCB1的光结合性标记，共聚焦显微镜结果也显示FG020326直接与ABCB1结合发挥逆转作用；ATPase活性实验则显示FG020326浓度依赖性地抑制ABCB1ATPase活性，表明FG020326可能不是ABCB1底物。体内逆转MDR研究表明FG020326(100mg/kg，p.o)与紫杉醇(18mg/kg，i.p)联合可以显著增加紫杉醇对以KBv200细胞建立的裸鼠移植瘤的抗肿瘤活性，抑瘤率为51.7％，而与生理盐水对照组相比，FG020326或紫杉醇单独用药则无明显抑瘤作用，重要的是联合用药组未见明显增加紫杉醇的毒副作用。FG020326(100mg/kg，p.o)无论是先于紫杉醇(18mg/kg，i.v)1h灌胃还是和紫杉醇同时尾静脉注射(FG020326，30mg/kg，p.o，紫杉醇，18mg/kg，i.v)均对紫杉醇的药代动力学无显著影响。 下调ABCB1表达也可逆转ABCB1介导的MDR，但FG020326不影响ABCB1在KBv200细胞中的表达；FG020326对ABCC1，ABCC4，ABCG2和LRP介导的MDR无明显逆转作用。 2.体外评价中lapatinib不仅显著逆转ABCG2转染细胞对ABCG2底物米托蒽醌的耐药性，而且显著恢复经药物诱导表达突变型ABCG2细胞S1-M1-80对米托蒽醌和拓扑替康的药物敏感性；Lapatinib还显著增强ABCB1过表达MDR细胞对阿霉素，长春新碱，紫杉醇和柔红霉素的敏感性；重要的是，lapatinib体外显著增加ABCB1高表达白血病患者白血病细胞对阿霉素和柔红霉素的药物敏感性；尽管lapatinib与阿霉素合用对MCF—7细胞，与米托蒽醌或拓扑替康合用对S1细胞产生小的协同作用，但不改变非ABCB1和ABCG2底物顺铂对MDR细胞的细胞毒作用；Lapatinib对ABCC4和LRP介导的MDR无明显逆转作用. 结论： 1.FG020326在体外和体内逆转ABCB1介导的MDR，对ABCC1，ABCC4，ABCG2和LRP介导的MDR则无明显逆转作用。 2.FG020326可能不是ABCB1底物，不影响合用抗癌药物紫杉醇的药代动力学，通过与ABCB1直接作用抑制ABCB1药物外排泵功能发挥逆转作用，是有开发前景的第三代MDR逆转剂。 3.Lapatinib通过抑制ABCB1和ABCG2药物外排泵功能在体内和体外逆转ABCB1和ABCG2介导的MDR，这种逆转作用不依赖于lapatinib对EGFR和HER2酪氨酸激酶磷酸化的阻断作用。 4.Lapatinib可能足ABCB1和ABCG2底物，影响合用紫杉醇的药代动力学，对于指导临床联合用药，揭示lapatinib耐药性的产生提供依据。 5.Erk1/2磷酸化水平在KBv200细胞的生存中可能不起主要作用。 6.Lapatinib在体外增加ABCB1底物阿霉素和柔红霉素对ABCB1高表达白血病患者白血病细胞的细胞毒作用，为克服白血病多药耐药提供理论依据。 7.Lapatinib对ABCC4和LRP介导的MDR没有明显逆转作用。 8.Sunitinib通过抑制ABCG2药物外排泵功能逆转ABCG2介导的MDR.对指导sunitinib临床联合ABCG2底物化疗具有一定意义。 9.Sunitinib对ABCB1，ABCC1和LRP介导的MDR没有明显逆转作用。