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[目的]近年来,肠道菌群在结直肠肿瘤的发生发展中起的作用已被日益证实。测序技术的高速发展,为肠道菌群的培养提供了新的培养方法和思路。结直肠肿瘤TNM分期根据肿瘤大小、淋巴结转移,和远处转移分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期,为临床的治疗和预后提供了基础。菌群在结直肠肿瘤分期中的变化,以及菌群在各个分期中的作用仍是未知的。此外肠道作为人体菌群的主要集聚地,能够通过纯培养的菌群仅仅为肠道菌群数量的1%,设计不同的分离培养条件,对各时期患者粪便分别进行分离纯化培养,得到纯化的单菌落,利用16S rRNA基因测序确认菌株种类和生物学特性。从而为我们探索结直肠癌患者肠道微生物的可培养性以及进一步研究其生物学功能提供一定的基础。通过此研究为结直肠肿瘤的预防与治疗提供理论基础,并探究设计不同的分离培条件,从结直肠癌患者粪便中培育出有价值的菌株,为后续实验和临床诊断提供一定的基础。[方法]1.收集正常人8例,Ⅱ期患者6例,Ⅲ期患者8例,Ⅳ期患者7例的粪便标本,并分别设置为N组、Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组。2.取部分标本送上海美吉生物公司进行环境样品16S rRNA基因测序;并利用其生物云平台对菌群多样性进行分析。3.取各分期部分标本进行菌株分离培养,确定为单菌落后,取PCR产物送往生工生物工程股份有限公司测序,对菌株进行初步鉴定后,保藏。4.结合多样性分析和菌株分离培养结果,在Pubmed上查阅此菌株的生物学功能及其与疾病的相关性。5.选出查阅文献后可能的细菌,液体培养基培养后低速离心后取上清,并过滤,过滤液与结直肠肿瘤细胞共培养进行CCK8检测是否影响肿瘤细胞的增殖。[结果]1.群落Bar图分析可以发现4分组间优势物种组成基本相似,但优势物种的丰度有一定的差异;图中显示,从属水平上进行分析发现:4分组间主要组成菌属为:Bacteroides（拟杆菌属）、Prevotella 9（普氏菌属）、Faecallbacterium（粪球菌属）、Shigella-Escherichia（志贺氏菌属）、Lachnoclostridium（毛螺菌属）、Agathobacter、Blautia、Akkeransia（艾克曼菌属）。Bacteroides（拟杆菌属）Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组相比于N组有降低;Prevotella 9（普氏菌属）和Faeca llbacterim（粪球菌属）Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组相比于N组明显降低,尤其是在ⅠV组中;而Shigella-Escherichia（志贺氏菌属）Ⅱ组与N组有降低,而在Ⅲ组、Ⅳ组增加,尤其是在Ⅳ组中显著增加;Lachnoclastridium（毛螺菌属）在Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组相比于N组升高;Agathobacter在Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组相比于N组减少;Blautia在Ⅱ组、Ⅲ组相比于N组增高。而相比于N组,Akkerm ansia（艾克曼菌属）在Ⅲ组、Ⅳ组明显增加。2.通过4个组在门水平的群落饼图可以发现:Firmicutes（厚壁菌门）、Ba cteroidetes（拟杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）3种菌门在4个组中为优势菌门,这3种优势菌门在各组之和和占据各组超过90%以上,且在除N组之外的3组中Firmicutes的丰度所占各组的比例都是最高的。N组中各菌所属的门的比例为 Firmicutes（46.05%）、Bacteroidetes（48.19%）、Proteobacteria（5.33%）、Actinobacteria（放线菌门）（0.36%）、Fusobacteria（梭杆菌门）（0.03%）、Verr ucomicrobia（疣微菌门）（0.01%）、Synergistetes（互养菌门）（0.01%）。在 Ⅱ 组中:Firmicutes（47.74%）、Bacteroidetes（45.36%）、Proteobacteria（2.43%）、A ctinobacteria（1.30%）、Fusobacteria（2.83%）、Verrucomicrobia（0.21%）、Syne rgistetes（0.02%）,Ⅱ 组相比于 N 组,Firmicutes、Actinobacteria、Fusobacteria、Verrucomicrobia、Synergistetes等门的菌株比例升高,而Bacteroidetes、Proteob acteria降低。Ⅲ 组中:Firmicutes（43.47%）、Bacteroidetes（34.97%）、Proteob acteria（13.60%）、Actinobacteria（0.56%）、Fusobacteria（3.68%）、Verrucomic robia（3.68%）、Synergistetes（0.00%）,Ⅲ 组相比于 N 组,Proteobacteria、Ac tinobacteria、Fusousobacteria、Vrrucomicrobia等门的菌株所占比例升高,而Firm icutes、Bacteroidetes、Synergistetes降低。Ⅳ 组中:Firmictutes（44.81%）、Bact eroidetes（32.85%）、Proteobacteria（9.73%）、Actinobacteria（0.70%）、Fusoba cteria（1.22%）、Verrucomicrobia（7.12%）、Synergistetes（3.42%）,Ⅳ组相比于 N 组,Proteobacteria、Actinobacteria、Fusobacteria、Verrucomicrobia、Syn ergistetes等门的菌株所占比例升高,此外Firmicutes和Bacteroidetes两门的菌株丰度降低。[结论]1.正常组的丰富度相比于结直肠肿瘤患者组的群落丰富度低;但正常组群落多样性要高于肿瘤患者组;其次在三组肿瘤患者的α多样性对比中,虽无统计学意义但群落丰富度和群落多样性在晚期肿瘤组（Ⅲ组和Ⅳ组）要低于早期组（Ⅱ组）。2.4个组中优势物种在属水平上的组成基本相似,但优势物种的丰度有一定的差异。3.组间差异检验中,发现在属水平上有12个菌属在各期之间具有统计学差异。其中Agathobacter、Lachnospira（毛螺菌属）、LachnospiraceaeNC2004gro up、LachnospiraceaeND3007group、Tyzzerella3这四种菌属的减少可能与结直肠肿瘤的发生相关。Bifidobacterium（双歧杆菌属）、Peptostreptococcus（消化链球菌属）、Prevotella（普氏菌属）在Ⅱ期患者中数量明显高于其他组,可能结直肠肿瘤发生的驱动菌群,这些菌属或许可以作为早期结直肠肿瘤诊断中的辅助指标。Eggerthella、Gemella（孪生球菌属）和Erysipeatocl ostridium在结直肠肿瘤的后期（Ⅲ期和Ⅳ期）明显增加,可能是肿瘤发展的驱动菌。4.在16S rRNA基因功能预测中,发现生物学功能在Biosynthesis of amino acids、ABC transporters、Carbon metabolism、Ribosome、Purinemetabolism、Pyrimidine metabolism、Quorumsensing、Two-component sustem等肿瘤组（Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组）明显高于正常组。5.多样性分析表明,N组与疾病各组样本之间微生物组成区分明显,随着结直肠癌的发展,各组的微生物结构组成差异变大,从Ⅱ期到Ⅳ期逐渐偏离N组的微生物结构。表明在结直肠肿瘤各期中核心菌群明显不同。6.肠癌患者样本来源的纯培养细菌绝大多数为致病菌,表明在结直肠肿瘤发展中致病菌逐渐富集影响肿瘤的进展。7.纯培养实验中,发现了4个潜在新的物种（相似性<97%）,需进一步验证;在菌株的纯培养过程中,分离得到大量的志贺杆菌,其可能和结直肠肿瘤发生有关,但志贺杆菌的致癌作用未见报道。