2012年发现的irisin是一种新型肌肉因子,可以通过刺激解耦联蛋白-1(uncoupling protein-1,UCP1)的表达促进白色脂肪细胞转换成棕色脂肪细胞。Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白 5(type Ⅲ domain-containing protein 5,FNDC5)是由两个纤连蛋白结构域、一个信号肽和一个嵌入细胞膜的疏水结构域构成的跨膜蛋白,FNDC5在细胞膜上发生水解生成irisin。小鼠FNDC5过表达可改善肥胖小鼠胰岛素抵抗和糖耐量异常。肥胖人群血清irisin浓度与肝脏甘油三酯(triacylglycerol,TG)含量负相关。本论文分为两个部分,分别探讨了(1)irisin在2型糖尿病模型小鼠肝脏糖异生和糖原合成中的作用与机制;(2)FNDC5在小鼠肝脏脂肪酸氧化、自噬、脂肪从头合成及脂肪变性中的作用。一、Irisin减轻糖尿病模型肝脏糖异生、促进糖原合成的作用与分子机制1.背景高血糖和胰岛素抵抗是2型糖尿病典型特征。肝脏参与葡萄糖的代谢过程,是调节血糖的主要器官,在葡萄糖的贮存、分布和调节上具有重要意义。当血糖浓度升高时,肝脏通过糖原合成将血糖转变成糖原贮存于肝脏,并通过将过剩的葡萄糖转变为脂肪和加速磷酸戊糖循环等途径,维持血糖浓度相对稳定。相反,当葡萄糖供应不足、肝糖原储备减少时,肝脏可将乳糖、甘油及生糖氨基酸等通过糖异生作用转化为葡萄糖(剧烈运动和饥饿时尤为显著)。2型糖尿病时由于胰岛素抵抗和肝脏对血糖调控失衡,通常表现出糖异生异常增强,而肝脏糖原合成减弱。肝脏对糖异生和糖原合成调控的失衡进一步加重2型糖尿病血糖紊乱和胰岛素抵抗,形成恶性循环,因此逆转或抑制肝脏糖异生过度激活,增加肝糖原合成是防治2型糖尿病的重要策略之一。Irisin在2型糖尿病肝脏糖异生和糖原合成中是否发挥作用尚不明确,本研究主要探讨irisin对肝糖异生和糖原合成的作用及下游信号通路。2.目的本研究拟探讨irisin在胰岛素抵抗肝细胞和2型糖尿病模型小鼠肝脏糖异生和糖原合成中的作用及分子机制,并探讨小鼠皮下给予irisin对葡萄糖代谢紊乱和胰岛素抵抗的治疗作用。3.方法人肝癌细胞系(HepG2)培养在含25mM葡萄糖、10%FBS和1%双抗(100 units/ml青霉素,100μg/ml链霉素)的DMEM培养基中并保持37℃、5%的C02和饱和湿度。小鼠原代肝细胞培养在含10%生长因子,10%FBS和1%双抗的专用原代肝细胞培养基中。动物实验采用C57BL/6J小鼠,6周龄雄性C57BL/6J小鼠适应环境1周后,将其随机分为三组,各7只,Ctrl组腹腔注射10mmol/l柠檬酸盐缓冲液并给予正常饮食(14.7 kJ/g,13%脂肪含量)。另外两组小鼠都接受单次小剂量腹腔注射链脲霉素(strePtozocin,STZ)合并高脂饮食以诱导2型糖尿病模型,3周后,给予这两组小鼠高脂饮食(21.8 kJ/g,60%脂肪含量),8周后将这两组糖尿病成模小鼠皮下微量渗透泵的形式分别给予生理盐水或irisin,期间小鼠维持高脂饮食状态,2周后三组小鼠进行取材和急性实验。采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定irisin和胰岛素水平。用葡萄糖脱氢酶偶联反应和乳酸脱氢酶偶联反应分别测定葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase)和磷酸烯醇丙酮酸竣激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)活性。蛋白质免疫分析技术(Western blotting)检测蛋白 PEPCK,G6pase,糖原合成酶(glycogen synthase,GS),磷酸化 GS,糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK3),磷酸化GSK3,蛋白激酶B(ProteinkinaseA,Akt),磷酸化Akt,磷脂酰肌醇-3激酶 100α(Phosphoinositide 3-kinase 100α,PI3K100α)和 PI3K100β,叉头转录因子1(Forkhead box O1,FOXO1),磷酸化FOXO1和磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)表达。用 real-time PCR(RT-PCR)法检测 PEPCK、G6pasemRNA 水平。采用过碘酸希夫染色(Periodic Acid-Schiff stain,PAS)染色法检测小鼠肝脏糖原含量;葡萄糖耐量(Glucose tolerance test,GTT)和胰岛素耐量(Insulin tolerance test,ITT)实验检测小鼠葡萄糖代谢和胰岛素抵抗情况;用葡萄糖氧化还原试剂盒和糖原检测试剂盒分别检测单位时间内肝细胞产糖量和糖原生成含量。4.结果(1)Irisin 减少葡萄糖胺(Glucosamine,GlcN)和棕榈酸(palmitate)对 HepG2细胞PEPCK、G6Pase mRNA和蛋白表达以及单位时间产糖量的促进作用。(2)Irisin通过促进GSK3蛋白磷酸化,抑制GS蛋白磷酸化,增加GlcN和棕榈酸诱导肝细胞肝糖原合成作用,增加肝糖原贮存量。(3)GlcN预处理HepG2细胞显著减少PI3K P100α和PI3K P100β蛋白的表达,irisin刺激HepG2细胞24h可升高PI3K P100α蛋白表达,对PI3K P100β蛋白表达无明显作用。Irisin通过增强PI3K/Akt信号通路抑制FOXO1活性。Irisin与胰岛素均可增加肝细胞Akt和FOXO1磷酸化,表明irisin和胰岛素均可激活PI3K/Akt信号通路。(4)Irisin对糖异生作用的抑制效应可被PI3K抑制剂LY294002或Akt抑制剂MK2206所阻断;Irisin通过促进GSK3蛋白磷酸化,抑制GS蛋白磷酸化从而增强胰岛素抵抗HepG2细胞糖原合成作用,增加肝糖原贮存,该效应可被PI3K抑制剂或Akt抑制剂所阻断。(5)链脲霉素(streptozocin,STZ)/高脂饮食(Highfatdiets,HFD)诱导 2 型糖尿病小鼠血清和肝脏irisin水平均低于对照组小鼠,皮下微量渗透泵给予irisin(STZ/HFD-irisin组)明显增高血清和肝脏irisin水平,但对小鼠的体重、饮食量和尾动脉收缩压并无作用。(6)STZ/HFD小鼠空腹血糖水平明显高于Ctrl组小鼠,血清胰岛素水平无差异,微量渗透泵给予irisin可降低STZ/HFD小鼠空腹血糖,改善葡萄糖耐量和胰岛素抵抗,增加肝脏糖原合成与贮存,而对血清胰岛素水平无影响。(7)皮下给予irisin通过PI3K/Akt信号通路下调小鼠肝脏PEPCK和G6Pase蛋白和mRNA表达;增强GSK3磷酸化,减弱GS磷酸化,从而改善STZ/HFD诱导的2型糖尿病小鼠肝脏糖异生过度增强和肝脏糖原合成减少。5.结论Irisin通过PI3K/Akt/FOXO1信号通路下调PEPCK和G6Pase活性,抑制糖异生作用;通过PI3K/Akt/GSK3信号通路增强GS活性,促进糖原合成。长期皮下给予irisin可以改善2型糖尿病小鼠高血糖症和胰岛素抵抗。二、FNDC5促进小鼠肝脏自噬和脂肪酸氧化、减轻脂肪从头合成的作用与分子机制1.背景非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)以肝细胞中甘油三酯(triacylglycerol,TG)过度增加为其主要特征。脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)是在供氧充足的情况下发生在线粒体的氧化反应,脂肪酸经活化生成乙酰辅酶A(acetyl-CoA),acetyl-CoA转移至线粒体,在线粒体中生成酮体或进行β氧化,最终经三羧酸循环彻底被氧化成二氧化碳和水,并释放出大量能量供机体利用。自噬是溶酶体介导的一种细胞死亡方式,是具有高度保守性的自我保护机制。自噬以囊泡的形式吞噬受损和需降解的自身细胞质蛋白或细胞器,形成自噬小体,自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以此实现细胞和细胞器的代谢和更新。FAO和自噬功能减弱以及脂肪从头合成(de novo lipogenesis)加强是肝脏脂质过度沉积的重要影响因素。因此寻找调控FAO、自噬或脂肪从头合成的靶分子成为治疗肝脏脂肪变性的重要策略之一。Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白 5(Fibronectintype Ⅲ domain-containing protein 5,FNDC5)是由一个信号肽、两个纤连蛋白结构域和一个嵌入细胞膜的疏水结构域构成的Ⅰ型膜蛋白。尾静脉注射FNDC5全长腺病毒可减轻饮食诱导肥胖小鼠体重。有氧运动可使骨骼肌中FNDC5表达增多,FNDC5在细胞膜发生水解生成irisin,irisin进入循环并通过血液到达脂肪组织,具有促使皮下白色脂肪组织发生棕色变性的作用,并参与调节有氧运动介导的各种代谢改变。本实验室前期研究发现慢病毒过表达FNDC5可显著增强高脂饮食诱导肥胖小鼠能量消耗,减轻高糖血症和胰岛素抵抗,并可促进脂肪组织脂解。然而FNDC5是否参与肝脏脂肪变性、自噬以及脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)的调控仍然未知。2.目的本研究拟探讨FNDC5在脂肪酸氧化、自噬、脂肪从头合成以及肝脏脂肪变性中的作用及分子机制,并探讨尾静脉注射FNDC5过表达腺病毒对肝脏脂肪变性的作用。3.方法使用4-8周龄雄性C57/BL6J(WT)小鼠和以C57/BL6J小鼠为背景的FNDC5敲基因(FNDC5-/-)小鼠。胶原酶消化法分离WT和FNDC5-/-小鼠原代肝实质细胞。4周龄WT和FNDC5-/-小鼠喂养12周高脂饮食诱导肥胖小鼠模型。酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),Western blot和RT-PCR确认FNDC5基因敲除有效性。采用酶法测定血清和细胞组织中甘油三酯(triacylglycerol,TG)、总胆固醇(total cholesterol,CHO)、游离脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase,AST)浓度。RT-PCR 检测 FAO、自噬和脂肪从头合成基因(Hmgcs2,Cpt1,Acox1,Ehhadh,Acsl1,Peci,Cyp4a10,Cyp4a12;UNC51-like kinase 1(Ulk1),Ulk2,Atg5,Atg8,Atg10;Srebplc,Dgat1,Fasn,Scd1)表达水平。Western Blot 和免疫组化法检测 AMPK/mTORC1(AMPK、S6、raptor)及自噬相关蛋白(p62,LC3B,ULK1)表达水平。油红O染色法检测肝脏组织和细胞脂肪沉积。采用14C放射性元素标记法测定FAO速率。mRFP-GFP-LC3B自噬双标腺病毒转染,观察自噬流发生。4.结果(1)与同龄WT小鼠相比,8周龄FNDC5-/-小鼠基础状态下肝脏出现轻度脂肪沉积,禁食后肝脏出现严重脂肪沉积。禁食后FNDC5-/-小鼠血清NEFA、TG以及NEFA水平显著高于WT小鼠。(2)FNDC5-/-小鼠基础状态与禁食后肝脏FAO相关基因表达均低于WT小鼠,AMPK 激动剂(AICAR)和 PPARα激动剂(WY14643)增加 FNDC5-/-小鼠 FAO基因的表达,减少肝脏脂质沉积;AMPK siRNA加重WT和FNDC5-/-小鼠肝脏及肝细胞脂质沉积,表明AMPK/PPARα介导FNDC5对自噬的调控作用。(3)mTORC1抑制剂雷帕霉素(rapamycin)可增加FNDC5-/-小鼠肝脏FAO基因表达,减少FNDC5-/-小鼠肝脏脂肪从头合成基因表达和小鼠肝脏TG含量。(4)饥饿或氨基酸剥夺处理明显减少WT小鼠肝脏和肝细胞自噬蛋白p62表达,增加LC3B蛋白表达以及自噬流的发生,而营养剥夺刺激对FNDC5-/-小鼠自噬作用影响不大。氨基酸剥夺处理或二甲双胍(metformin)可时间依赖性增加WT小鼠肝细胞AMPK、ULK1和raptor磷酸化,但对FNDC5-/-小鼠作用较弱。AMPK激动剂AICAR可增加WT和FNDC5-/-小鼠肝细胞自噬作用,AMPK siRNA减少WT和FNDC5-/-小鼠肝细胞自噬发生。(5)雷帕霉素处理可降下调FNDC5-/-小鼠肝脏和肝细胞中p62蛋白表达,上调LC3B蛋白表达。雷帕霉素处理显著增加WT和FNDC5-/-小鼠肝细胞自噬流发生,减少血清肝脏损伤指标(AST,ALT)水平。雷帕霉素对棕榈酸诱导的小鼠肝细胞脂质沉积的改善作用依赖于自噬基因Atg5。(6)FNDC5-/-/HFD小鼠肝脏质量和肝脏质量/体重比率高于WT/HFD小鼠,而两组小鼠体重和饮食量无差异。FNDC5基因缺失加重HFD诱导引起的肝脏脂质沉积、血清AST、ALT水平上调、FAO基因表达下调和脂肪从头合成基因表达上调。(7)外源性FNDC5时间和剂量依赖性增加小鼠肝细胞FAO基因表达,且在100nmol/L和24h作用达到峰值。外源性FNDC5通过AMPK/mTORC1信号通路减少FNDC5-/-小鼠肝细胞TG含量、促进自噬发生并改善棕榈酸诱导的脂肪沉积。(8)尾静脉注射FNDC5过表达腺病毒通过AMPK/mTORC1信号通路有效增强HFD诱导肥胖小鼠减弱的FAO和自噬,改善肥胖小鼠肝脏脂质沉积。5.结论FNDC5基因缺失小鼠肝脏FAO、自噬作用减弱;脂肪从头合成作用加强,肝脏脂肪变性加强。FNDC5通过AMPK/mTORC1信号通路增加FAO和自噬,减少脂肪从头合成,进而减少肝脏脂肪沉积和损伤。FNDC5可能成为治疗肝脏脂肪变性的重要策略之一。