外源褪黑素与褪黑素合成酶基因T5H-1在中华蜜蜂抗寒过程中的功能研究

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中华蜜蜂是我国特有的授粉昆虫,对维持我国生态系统的平衡性方面具有重要作用。近年来,冷胁迫问题在我国频繁发生,对中华蜜蜂的生存造成极大影响。褪黑素是一种胺类激素,最新研究表明褪黑素能够帮助生物体提高耐寒性,但其能否提高中华蜜蜂的耐寒性,目前还未见报道。因此本研究以中华蜜蜂为实验材料,通过在饲粮中添加外源褪黑素的方法,探索最佳饲喂浓度,并检测低温胁迫下中华蜜蜂体内抗氧化酶的活性、氧化物质的含量和耐寒性物质的含量,从生理性角度加以揭示外源褪黑素对中华蜜蜂抗寒性的影响;通过分离获得褪黑素合成通路中的色氨酸羟化酶AccT5H-1基因,并研究其基因作用机理,从分子水平探讨内源褪黑素对中华蜜蜂抗寒性的影响,为进一步开发出提高中华蜜蜂抗寒能力的褪黑素饲料提供理论基础。主要研究结果如下:(1)在中华蜜蜂日常的饲粮中添加10μg/mL的褪黑素,蜜蜂在低温下的存活率最高。(2)低温胁迫下,饲粮中添加外源褪黑素后提高了中华蜜蜂体内的甘油和糖原的含量,增强了中华蜜蜂的耐寒性。(3)低温胁迫下,外源饲喂褪黑素可以提高中华蜜蜂体内的抗氧化酶的活性和Vc含量,降低了氧化物质(MDA和H2O2)的含量,这说明外源褪黑素可以缓解低温胁迫对中华蜜蜂引起的氧化损伤。(4)AccT5H-1基因的生物信息学分析显示,中华蜜蜂的色氨酸-5-羟化酶-1(AccT5H-1)的开放阅读框(ORF)全长为1620 bp,编码539个氨基酸,预测其分子量为61.22 kDa,与意大利蜜蜂AmT5H-1的同源性较高。启动子序列分析发现AccT5H-1的启动子区域包含多种与应激反应相关的转录因子结合位点。(5)AccT5H-1基因的表达模式分析显示,AccT5H-1基因的表达受低温胁迫处理的诱导,参与了中华蜜蜂抵抗低温应激反应过程。(6)AccT5H-1基因沉默后中华蜜蜂体内抗氧化基因的表达量分析显示,沉默中华蜜蜂体内的AccT5H-1基因后,中华蜜蜂体内的AccTrxR1,AccGSTO1,AccGSTZ1,AccSOD1,AccTrxR-like,AccGSTO2,AccTpx4,AccGSTT1,AccCYP4G11,AccTpx5和AccGSTD等抗性基因的表达量均被上调,说明中华蜜蜂AccT5H-1基因在抵抗胁迫应激中起着不可或缺的作用。(7)AccT5H-1基因沉默后中华蜜蜂体内抗氧化酶活性活性均高于对照组;氧化物质MDA和H2O2含量升高,Vc含量降低,说明AccT5H-1基因在中华蜜蜂体内起到抗氧化的作用。
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