论文部分内容阅读
背景与目的：侵袭转移是导致胃癌患者死亡的主要原因,有关其分子机制的研究一直以来是胃癌研究领域的热点。EGFL7是一种分泌型促血管生成因子,在许多肿瘤中都可发现其高表达。本课题组前期研究发现降低胃癌细胞BGC823中的EGFL7基因表达后,细胞的侵袭迁移能力下降,并伴有miR-1246的表达上调,但具体效应机制不清。miR-1246是一新发现的miRNA,目前有关它的研究较少,关于它在胃癌中作用的研究尚未见报道。本研究旨在探讨miR-1246对胃癌细胞生物学行为的影响,并通过靶基因预测网站预测、双荧光素酶报告基因实验验证等方法,探讨、验证miR-1246的效应分子,以此来说明EGFL7基因低表达后BGC823细胞侵袭迁移能力的下降可能与miR-1246及其预测靶基因有关,为研究miR-1246在胃癌中的作用提供了新思路,也为研究EGFL7在胃癌中作用机制及其后续的分子靶向治疗提供新视角。方法：(1)用Real-time PCR验证BGC823、BGC823-NC(阴性对照组BGC823稳定细胞系)、BGC823-E(EGFL7低表达的BGC823稳定细胞系)三组细胞中miR-1246表达情况；(2)Western blotting和Real-time PCR检测BGC823、BGC823-NC、BGC823-E三组细胞中N-cadherin表达情况；(3)转染miR-1246mimics后胃癌细胞BGC823的侵袭迁移能力变化及其预测靶基因N-cadherin的蛋白和mRNA表达情况；(4)转染miR-1246inhibitor后胃癌细胞BGC823-E的侵袭迁移能力变化及其预测靶基因N-cadherin的蛋白和]mRNA表达情况；(5)将含有与miRNA-1246结合位点的N-cadherin3’-UTR (野生型)及突变位点(突变型)构建至双荧光素酶报告质粒中,与miR-1246mimics及Negative Control共转染至293T细胞中,检测双荧光素酶活性。结果：(1)三株细胞中BGC823-E中的miR-1246表达上调；(2)三株细胞中BGC823-E的N-cadherin蛋白表达减弱,而其mRNA变化不明显；(3)转染miR-1246mimics后胃癌细胞BGC823的侵袭迁移能力减弱,同时N-cadherin蛋白表达明显减弱,mRNA变化不明显；(4)转染miR-1246inhibitor后胃癌细胞BGC823-E的侵袭迁移能力增强,同时N-cadherin的蛋白表达增加,mRNA变化不明显；(5)与其他组比较,共转染mimics与野生型质粒组的相对荧光素酶活性明显下降,表明miR-1246能够与N-cadherin的3’-UTR结合。结论：(1)miR-1246能够抑制胃癌细胞BGC823的侵袭迁移,其机制可能与下调靶基因N-cadherin蛋白的表达有关；(2)miR-1246可直接靶向调节N-cadherin的表达,其机制与抑制其mRNA翻译有关；(3)EGFL7下调引起BGC823细胞侵袭迁移能力的下降,可能与miR-1246的靶基因N-cadherin蛋白表达降低有关。