研究目的:急性肠缺血(acute intestinal ischemia,AII)是一种少见,但病情凶险,病死率高的腹部血管危重症。严重的脓毒症、休克、创伤等,均可伴有不同程度的肠道血流受限,导致低灌注性肠功能损伤。急性肠缺血进一步加重,可破坏肠道固有的屏障功能,导致内毒素入血,诱导系统性炎症反应综合征(systematic inflammatory response syndrome,SIRS),甚至及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的发生。大量的研究表明,炎症反应是缺血后肠道损伤的主要原因之一,中性粒细胞(neutrophil,PMN)作为机体抵抗感染最主要的细胞,在其中发挥着关键作用。经典的学说认为,PMN可通过直接吞噬病原体的方式杀灭细菌。然而2004年,Brinkmann等人发现了 PMN杀菌的另一种全新的机制—中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps,NETs)。PMN受到刺激活化后,胞膜破裂,在胞外形成以DNA为骨架的网络结构,网络结构上吸附有各种杀菌蛋白、水解酶等。早期的研究认为,NETs在机体抵抗外来感染的过程中发挥重要作用,其独特的网络结构可有效的局限、捕获细菌,网络结构内含有的高浓度的蛋白酶可进一步降解并杀灭细菌。然而随着研究不断深化,科研人员发现过量释放的NETs可对机体造成不利的影响。NETs及其固有成分DNA、组蛋白等作为一种损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),可诱导炎症反应、凝血激活(excessive activation of coagulation)、细胞凋亡等;NETs在形成过程伴有大量胞内和核内自身抗原暴露,可诱发自身抗体形成,导致各种自身免疫性疾病发生。同时,以NETs靶向治疗为基础的治疗策略在不同疾病的动物模型中取得显著进展,这为临床治疗NETs相关疾病提供了新的研究窗口及治疗思路。因此,确切的研究NETs对急性肠缺血肠屏障功能的影响显得至关重要。本研究旨在探究急性肠缺血时PMN释放NETs影响肠道屏障功能的作用机制,以期从一种新的角度对急性肠缺血引起的微循环障碍、组织细胞损伤等进行深入研究,并寻找新的靶向治疗手段。第一部分研究方法:通过经典的夹闭肠系膜上动脉技术,构建SD大鼠急性肠缺血动物模型。无创动脉夹夹闭肠系膜上动脉1h,松开动脉夹。按建模后给药时间分为:Oh组、2h组、4h组及6h组。于各组时间点给予外源性DNase-1降解NETs,建模后24h处死动物并取材。应用ELISA、免疫荧光技术检测血清及肠道组织NETs的表达情况;运用HE染色、WB分析、免疫组化等技术检测肠道病理学变化;运用ELISA技术检测血清炎症因子的表达。探究NETs在急性肠缺血模型中的表达情况,并进一步比较不同时间靶向清除NETs对于急性肠缺血肠屏障功能损伤的影响。研究结果:急性肠缺血大鼠血清MPO-DNA含量显著升高,DNase-1处理后,大鼠体内MPO-DNA含量明显降低;相比其他组,建模后Oh给药组大鼠IL-6、TNF-α水平最高,肠道病理损害最为严重,肠粘膜紧密连接蛋白表达明显降低;建模后4h给药组大鼠体内IL-6、TNF-α水平明显降低,肠道组织病理评分升高,肠粘膜紧密连接蛋白表达明显恢复。第二部分研究方法:基于第一部分实验结果,选择最佳的DNase-1干预时间节点,对比DNase-1单一给药与联合低分子肝素抗凝治疗疗效。应用ELISA、免疫荧光技术检测血清及肠道组织NETs的表达情况;运用HE染色、WB分析、免疫组化等技术检测肠道病理学变化;运用ELISA技术分析血清炎症因子的表达情况。探索抗凝治疗对于大鼠体内NETs产生的影响;进一步分析DNase-1联合低分子肝素对急性肠缺血肠道微循环障碍的影响。研究结果:DNase-1及依诺肝素均可不同程度缓解肠道微循环损伤;相较其他组,联合给药组大鼠体内炎症指标IL-6、TNF-α水平明显下降,肠道HE提示联合给药可明显缓解的大鼠肠道病理损伤。研究结论:(1)急性肠缺血大鼠模型体内NETs表达与肠道炎症及肠道病理损伤呈现明显的相关性;(2)建模后4h予以DNase-1清除NETs,可明显降低动物体内NETs表达,改善大鼠全身炎症反应,保护肠粘膜上皮细胞功能,维护肠粘膜上皮细胞间紧密连接蛋白的完整性;过早清除NETs会破坏NETs对于疾病早期的杀菌作用,引起细菌播散,内毒素入血,加重肠道损伤。(3)抗凝治疗可一定程度减轻大鼠体内NETs表达,但可明显减弱肠道炎症,改善NETs过度释放引起的血液高凝状态,保护肠粘膜屏障功能;(4)DNase-1联合低分子肝素治疗,可显著降低大鼠体内NETs表达,改善大鼠全身状况,促进肠道上皮细胞功能恢复,减轻肠屏障功能损伤。