布氏杆菌病是由布氏杆菌引起的一种人畜共患病,给畜牧业的发展和人类的健康带来严重的危害。世界统计资料表明,每年因布氏杆菌病造成的经济损失将近30亿美元。由它引发的人类波浪热、慢性感染以及反刍动物流产和睾丸炎等疾病,至今仍无法根治。此外,布氏杆菌还被用作生物武器。由此可见,布氏杆菌对我国经济建设、人民健康生活、国家安全等存在着严重威胁。布氏杆菌病的发病特点是,一旦发病并转入慢性就无法治愈,因此,控制布氏杆菌病最关键的是预防。传统的血清学诊断存在假阳性血清学反应。假阳性的原因是由于布氏杆菌S-LPS与其他一些革兰氏阴性菌表面的LPS的相似结构引起的交叉反应。常用的布氏杆菌病血清学诊断方法无法区分疫苗免疫和自然感染而引起的血清学反应,研制具有标记性的疫苗以及寻找合适的布氏杆菌诊断性抗原一直是研究者的目标。BP26蛋白是布氏杆菌的一个周质蛋白,是布氏杆菌非常重要的诊断抗原之一,已有很多用此抗原来进行布氏杆菌诊断的报道。BP26蛋白对布氏杆菌的毒力不起决定性的作用,但却是布氏杆菌的一个优势抗原,能够诱导产生高滴度的抗体。BP26的这个特性,为我们研究基因标记疫苗提供了很好的靶标。如果将该抗原进行缺失标记,一方面可能将标记株的毒力降低,另一方面也为建立鉴别诊断方法提供标识序列。本研究通过原核表达系统表达并纯化两种蛋白pET-30a(+)-bp26和pGEX-6P-1-bp26。用重组蛋白pET-30a(+)-bp26免疫6周龄BALB/c小鼠,加强免疫后取脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。应用重组蛋白pGEX-6P-1-bp26作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。经4次克隆,获得5株抗体效价较高的抗BP26蛋白特异性单克隆抗体,分别命名为:3AG5、3AG6、3CE10、4EA2和4EF3。亚型分析得出:重链亚型均为IgG1,轻链均为Kappa链。应用大肠杆菌O:157、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、沙门氏菌等菌体裂解液作为抗原检测,均无交叉反应。Western blotting特异性检测这5株MAbs,与B.melitensis M5-90天然菌体反应,但是不与M5-90-△26缺失疫苗株反应。这5株单克隆抗体具有高度特异性,在布氏杆菌的检测方面,具有潜在的应用价值。本研究将制备的单克隆抗体初步应用于竞争ELISA中,发现此单克隆抗体对牛种布氏杆菌的检测效果较为理想,有望将其应用到布氏杆菌的临床检测中。可以根据本研究制备的单克隆抗体来建立血清学鉴别诊断方法,以及区分是自然感染还是疫苗免疫,能够为本研究组构建的两株bp26基因缺失标记疫苗株的应用和诊断提供理论基础。