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研究背景主动脉夹层假腔远端动脉瘤样扩张（Distal aneurysmal expansion of false lumen of aortic dissection,DAEAD）是主动脉夹层进展的表现。经过长期随访,每3例Stanford主动脉夹层患者经腔内隔绝术治疗后就有1例出现DAEAD,且绝大多数患者在长期随访过程中需要再次接受治疗。但一旦进展成为DAEAD,由于其解剖学的高度复杂性,广泛累及内脏分支动脉的DAEAD时不论采取开放手术还是腔内治疗都具有高风险。目前,有越来越多的证据表明主动脉疾病与基因突变相关。从基因治疗的角度解决与遗传相关的主动脉疾病面临两个问题,一方面,缺少明确、有效的输送载体让基因修复工具到达主动脉靶位点,另一方面,如何对与遗传相关的主动脉疾病进行基因编辑也是亟待研究的问题。因此,本研究拟从遗传学研究的角度,探究DAEAD与基因突变的相关性;研究探索合适的AAV血清型作为基因治疗的输送载体;且从基因层面能否实现对发生FBN1点突变的马凡综合征患者的原代主动脉平滑肌细胞序列上的修复。研究目的1.研究探索主动脉夹层假腔远端动脉瘤样扩张与临床和基因的相关性。2.探索能够最佳感染主动脉根部和胸主动脉的腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）血清型,并研究其在主动脉不同节段处的感染差异。3.通过CRISPR/Cas9技术,实现对FBN1点突变的马凡综合征患者的原代主动脉平滑肌细胞的修复。研究方法1.回顾性分析本中心2013年4月至2020年10月影像学诊断为主动脉夹层假腔远端动脉瘤样扩张和术后正常的患者,统计并比较两组患者围手术期结果和致病基因分析,并与数据库中健康人群的健康对照组等位基因进行比对。2.利用分子克隆技术,针对性的设计入核、携带表达红色荧光的质粒后,包装不同AAV血清型（AAV1,AAV2,AAV4,AAV6和AAV9）的病毒,对C57小鼠进行尾静脉注射。从免疫荧光和实时荧光定量PCR两个方面对其在主动脉根部和胸主动脉处的感染效率进行对比。并且对比分析了感染效率最高的AAV9在主动脉不同节段的感染情况。3.利用CRISPR/Cas9技术,筛选出合适sgRNA后,对FBN1基因点突变的马凡综合征患者的原代主动脉平滑肌细胞进行修复,并进行修复前后序列上的验证。研究结果1.DAEAD组腹腔干平面、左肾动脉平面和右肾动脉平面的假腔长径和短径长于非DAEAD组,肾下最大平面的假腔短径长于非DAEAD组,差异有统计学意义（P＜0.05）。基因分析显示,DAEAD组患者致病变异率为58.3%（7/12）,非DAEAD组中,没有发现致病变异。同时DAEAD组患者发现3个意义未知的变异体（VUS）;进一步将VUS风险变量分析扩展到与主动脉瘤和夹层相关重要途径中显示,DAEAD组和非DAEAD组的细胞外基质途径的VUS变异多于健康对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。2.成功构建入核、表达红色荧光的质粒。在主动脉根部和胸主动脉处的感染效率经计数后发现,除AAV2和AAV6均无感染外,AAV1、AAV4、AAV9两两之间的差异均有统计学意义（P＜0.05）。不同血清型（AAV1,AAV2,AAV4,AAV6和AAV9）中,在主动脉根部和胸主动脉处均以AAV9感染最佳,AAV4次之,AAV1几乎无感染。AAV2和AAV6均无感染。而AAV9在主动脉不同节段的感染中,各节段感染效率不全相同,其差异有统计学意义（P＜0.05）。其中除了主动脉弓与胸主动脉、腹主动脉与头臂干之间的感染差异无统计学意义外（P＞0.05）,其余各节段两两之间差异均有统计学意义（P＜0.05）。AAV9对小鼠主动脉不同节段的感染除了肾动脉和髂动脉未见感染外,其余各节段感染效率为:主动脉根部最佳,主动脉弓和胸主动脉次之,腹主动脉和头臂干感染最低。这表明AAV9对于小鼠主动脉各不同节段的感染具有差异性。3.该部分实验由早期发病、杂合子FBN1单碱基突变的马凡患者（c.3959G＞T）的主动脉处获得组织后,进行原代平滑肌细胞的培养。通过sanger测序的方式,结合突变位点,设计相关sgRNA,并进行了3种sgRNA的筛选后,选择最佳的sgRNA。运用CRISPR/Cas9的技术,对原代主动脉平滑肌细胞进行基因编辑。Sanger测序验证修复前后FBN1目的序列由单碱基杂合子突变成功修复,恢复正常的变化。结论1.本研究提示一些已知主动脉疾病的致病基因不仅与主动脉夹层发病有关,而且与其远期进展的不良预后有关。DAEAD的发生发展具有遗传相关性,可能是单基因遗传疾病中的高渗透性致病变异,也可能是多基因的联合作用。2.经过动物实验研究结果分析后显示,AAV1,AAV2,AAV4,AAV6和AAV9这5种血清型在主动脉根部和胸主动脉处的感染效率均以AAV9最好,AAV4次之。而AAV9在主动脉不同节段（主动脉根部,主动脉弓,胸主动脉,腹主动脉,头臂干,肾动脉和髂动脉）中,以主动脉根部感染效率最佳,因此,AAV9在感染主动脉根部和胸主动脉处相较于其他血清型有明显的优越性。3.运用CRISPR/Cas9的技术,对原代主动脉平滑肌细胞进行基因编辑。Sanger测序验证修复前后FBN1目的序列由单碱基杂合子（c.3959G＞T）突变成功修复的变化。证实了对马凡综合征的患者,在其原代主动脉平滑肌细胞系中进行基因编辑成功修复的可能性。