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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的可导致仔猪的严重病毒性疾病,尤其在东亚各国传播非常广泛,每年都造成严重的经济损失,同多数病毒性疾病的防制相同,对PED的防制仍以疫苗免疫预防为主。但目前所面临的问题是PEDV细胞适应难度大,繁殖条件复杂,病毒在细胞中培养繁殖滴度低,因此严重阻碍了PED疾病的防制。本实验为提高PEDV繁殖滴度、增加病毒产量及含量,应用病毒蚀斑技术,对PEDV蚀斑形成方法进行了摸索,建立了PEDV蚀斑形成方法,并通过所建立的蚀斑形成方法对PEDV LJB/03毒株进行了蚀斑克隆纯化,筛选出大小不同的两克隆株,分别命名为大蚀斑和小蚀斑,对病毒的部分生物学特性进行了研究。在对PEDV蚀斑形成方法进行摸索时,蚀斑形成条件最为重要,所确立的蚀斑形成条件中琼脂糖浓度为1.5%,培养液-琼脂糖混合培养液的最适温度为30℃左右,所用中性红浓度为0.01%左右,而对于小蚀斑克隆株的纯化过程中所需蚀斑形成条件又有所不同,它所需培养时间要长于大蚀斑形成所需时间,所需培养液要为最新配制的培养液,所需染液终浓度要高于正常蚀斑形成所需浓度约为0.05%,对于大蚀斑克隆株在克隆纯化过程中所用条件与蚀斑形成条件基本相同。本实验对大小蚀斑病毒及原病毒的理化特性进行了研究,耐热性试验结果病毒随着温度的升高病毒滴度随之降低,将4℃病毒的滴度设为对照,在37℃、42℃、50℃、65℃条件下,大蚀斑滴度降低极显著(P<0.01),原病毒在42℃条件下病毒的滴度降低差异显著(0.01<P<0.05),其它温度降低极显著,而小蚀斑除42℃条件下降低较显著外,其余降低差异不显著(P>0.05);PH稳定性试验结果大、小蚀斑和原病毒的滴度都有所降低,大蚀斑降低极显著(P<0.01),原病毒和小蚀斑降低显著(0.01<P<0.05);乙醚敏感性试验结果说明病毒对小于5%乙醚的敏感性较低,对于高于10%乙醚敏感,原病毒及大蚀斑与其对照相比差异极显著(P<0.01),而小蚀斑在在加入5%乙醚、10%乙醚后滴度与对照相比差异显著(0.01<P<0.05);胰蛋白酶敏感性试验结果在加入0.25%胰蛋白酶和0.5%胰蛋白酶病毒滴度都随胰蛋白酶浓度的增加滴度随之降低。对克隆纯化筛选出的大、小蚀斑克隆株的大小进行了测量,大蚀斑平均大小为2.07±0.04mm,小蚀斑平均大小为0.98±0.01mm;对两克隆株及原病毒TCID50进行测定,结果小蚀斑的滴度很低仅为102.15±0.08/mL,原病毒TCID50为105.51±0.02/mL,而大蚀斑的滴度要显著高于原病毒滴度,滴度可达106.08±0.08/mL;对其大小两种蚀斑的病毒滴度测定结果表明,大小蚀斑细胞感染滴度相差明显。对其细胞培养特性进行了研究,对繁殖病毒所用胰酶的终浓度进行了摸索得出,病毒繁殖的最佳胰酶浓度为40μg/mL,对不同培养条件对病毒滴度影响进行了研究,结果发现,病毒在吸附1.5h后弃液的培养条件下繁殖效果最佳,采用此最佳条件提高了病毒的滴度。本实验还采用静瓶和转瓶两种方式进行PED病毒的增殖,结果表明转瓶所繁殖出的病毒滴度较高,TCID50可达106.75±0.03/mL。以上研究结果为PEDV分离毒基础生物学特性及病毒相关应用研究奠定了重要的物质基础。