论文部分内容阅读
本研究从56份临床症状表现为体温身高,咳嗽,流鼻涕的犬中分离到流感病毒,经血凝和血凝抑制试验以及BLAST analysis最终确定为H5N2亚型。根据Genbank中流感病毒H5N2亚型各个基因序列,分别设计扩增各基因片段的特异性引物,用RT-PCR方法扩增犬流感病毒(CIV)泰安分离株CA/SD/JT01/09各段基因,并分别将RT-PCR产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析。为了研究H5N2流感病毒在犬中的流行情况,随后我们采集并制备了了大量的犬血清进行抗体分析,从小部分的犬血清中我们成功分离得到了H5N2抗体。这表明了H5N2流感病毒能够在犬中传播。CA/SD/JT01/09 HA基因长度为1467bp,编码466个氨基酸,HA蛋白切割位点序列为PQ↓REIRRK,属于非高致病性毒株;分离段HA含有4个氨基酸糖基化位点,分别为181-NNTD-,209-NPTT-,302-NSSM-,500-NGTY-,其中3个在HA1蛋白上,1个在HA2蛋白上,与个别参考毒株糖基化位点个数不同。CA/SD/JT01/09 HA蛋白在45、184、444位发生了氨基酸突变,但没有发生在HA重要的受体结合部位,其抗原性及其生物特性未发生变化;CA/SD/JT01/09 NA蛋白基因长为1172bp,编码388个氨基酸,包含4个氨基酸糖基化位点,其中第50和338位发生了氨基酸突变,导致NA颈部50位由V突变为A,可以推测对病毒的复制能力和宿主范围会产生一定的影响。NP基因分离长度为1594bp,编码499个氨基酸,其中与MD/Ita/36/2002(H5N3)的NP基因同源性最高,达到97%,分离毒株在339、376、461位的氨基酸分别为R、N、A,参考毒株为C、D、D。犬流感病毒CA/SD/JT01/09其余基因序列PB2、PB1、PA、M、NS片段扩增长度分别2174、2134、2062、1027、890,分别编码724、711、687、252、226个氨基酸,各个片段基因序列与参考毒株最高同源性都大于90%。系统发生分析表明,流感病毒CA/SD/JT01/09氨基酸序列与参考序列最大同源性均大于93.3%;其中HA基因与SW/FJ/F1/01(H5N1)的同源性最高,属于亚洲禽类谱系。NA蛋白与TK/WS/66(H9N2)同源性最高,亲缘关系最近,经分析表明NA基因属于早期北美禽类谱系。NP蛋白与SW/FJ/F1/01(H5N1)同源性最高,亲缘关系最近,属于欧洲谱系。其余片段均与SW/FJ/F1/01(H5N1)同源性最高,亲缘关系也最近。由此可以看出,该病毒基因来源比较复杂,所以该病毒可能是H5N1病毒与H9N2病毒的重组新病毒。这是世界上首次在犬中分离得到H5N2流感病毒,由于犬和人类的接触比较密切,CIV可能对人类的健康存在威胁,因此对犬流感的研究具有较深的公共卫生学意义。本实验成功分离并得到了H5N2流感病毒的8段基因序列,并对其基因序列和氨基酸序列以及同源性进行了分析,为进一步防治CIV的流行提供了重要的分子流行病学资料。