观察小鼠视网膜新生血管发生过程中乙酰肝素酶(heparanase,HPA)的表达情况及意义,探讨乙酰肝素酶对视网膜新生血管发生和发展的影响。方法1.乙酰肝素酶在小鼠视网膜新生血管中的动态表达(1)将130只新生C57BL/6J小鼠随机分为两组：①对照组,正常空气环境中饲养;②高氧组,将出生第7天的小鼠放入氧箱,在(75±2)%浓度的高氧环境中饲养5天后,取出氧箱置于正常空气环境中诱导产生视网膜新生血管。在小鼠生后第12,13,17,21,30天分别处死,制作视网膜铺片和切片,观察视网膜新生血管的发生情况。(2)应用免疫组织化学染色方法检测12,13,17,21,30天五个时间点高氧组与对照组小鼠视网膜中乙酰肝素酶、串珠素(perlecan)的表达情况及部位。(3)提取全视网膜RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测高氧组与对照组乙酰肝素酶、串珠素于上述时间点在基因水平的表达情况,并同时检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。(4)提取全视网膜总蛋白,应用免疫蛋白印迹方法(Western blot)检测上述各时间点高氧组与对照组乙酰肝素酶在蛋白水平的表达情况。(5)应用SPSS16.0统计学软件进行数据处理,采用双因素方差分析,分别比较高氧组与对照组小鼠出生不同时间mRNA与蛋白质的差异,以P<0.05作为差异有统计学意义。2.乙酰肝素酶干扰性RNA对小鼠视网膜新生血管的影响健康C57BL/6J新生小鼠40只,性别不限,随机分为4组:乙酰肝素酶siRNA治疗组、对照质粒组、高氧诱导组,正常对照组。正常对照组新生小鼠于正常大气环境饲养;乙酰肝素酶siRNA治疗组,对照质粒组及高氧对照组小鼠制作视网膜新生血管动物模型。乙酰肝素酶siRNA治疗组、对照质粒组于小鼠生后12天时双眼玻璃体腔注射质粒1μl(浓度为1μg/μl)。于术后5天(即出生后17天)观察小鼠视网膜新生血管形成情况,观察项目有:(1)伊文思蓝视网膜血管造影:2%伊文思蓝小鼠上腔静脉注射,处死后取眼球固定,分离视网膜进行铺片,荧光显微镜下观察视网膜血管情况并照相;(2)组织学检查及血管内皮细胞计数:处死动物摘取眼球,常规组织固定,石蜡包埋,连续组织切片,苏木素-伊红(HE)染色,每隔60μm取一张切片,含视乳头的切片弃去,光镜下观察计数突破内界膜的内皮细胞核,即新生血管内皮细胞,定量分析比较。(3)提取全视网膜总蛋白,应用免疫蛋白印迹方法检测上述各组别视网膜组织中乙酰肝素酶蛋白水平的表达情况。(4)应用SPSS16.0统计学软件进行数据处理,采用单因素方差分析比较生后17天上述四个组别乙酰肝素酶蛋白水平的差异,以P<0.05作为差异有统计学意义。结果1.乙酰肝素酶在小鼠视网膜新生血管中的动态表达(1)高氧诱导小鼠视网膜新生血管动物模型①视网膜铺片伊文思蓝灌注造影所有氧诱导模型小鼠均出现视网膜新生血管生成反应。视网膜铺片伊文思蓝灌注造影可以清楚、完整的显示小鼠视网膜新生血管模型中视网膜血管无灌注区、血管渗漏、新生血管形成等视网膜血管病变。正常小鼠在生后12、13、17、21、30天视网膜血管分布均匀,无异常改变。高氧诱导的小鼠视网膜在生后12天视网膜大面积的无灌注区,仅周边部视网膜下形成小面积的血管网;生后13天的小鼠因代偿反应造成血管扩张,见部分血管渗漏及少量微动脉瘤形成;生后17天视网膜明显迂曲、扩张,灌注区与无灌注区交界处发现大量的新生血管丛、微血管瘤及渗出。这种血管反应持续到生后21天,至生后30天时基本恢复正常。②视网膜病理切片观察正常组中很少见到突破视网膜内界膜的血管内皮细胞;而高氧诱导组中均有大量,其发生率为100%。生后13天时可以看到视网膜的内界膜面粗糙增厚,其中生后17天、21天见到的突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数最多。(2)免疫组织化学染色①HPA在视网膜中的表达部位在正常发育的生后17天小鼠视网膜组织中,HPA主要在神经节细胞层、外丛状层、光感器细胞层均有较弱的表达;另外在外丛状层的一些小血管上也有表达。高氧组小鼠生后12天,HPA主要于神经节细胞层有少许表达;生后13天HPA在神经节细胞层的表达明显增多;生后17、21天,随着视网膜新生血管的出现和增多,表现出共同的表达分布特征:HPA主要集中表达于突破与内界膜的血管内皮细胞和血管壁,神经节细胞层也有较强的表达。②HPA的重要作用底物一串珠素(perlecan)在视网膜中的表达部位在正常发育的生后17天小鼠视网膜组织中,perlecan主要在神经节细胞层、内丛状层、外丛状层、光感器细胞层都有较弱的表达。高氧组小鼠生后12天,perlecan在视网膜中的表达部位与正常发育的17天小鼠基本一致。生后13天时,perlecan的表达在神经节细胞层较前增多。生后17、21天,随着视网膜新生血管的出现和增多,perlecan主要集中表达于突破与内界膜的血管内皮细胞和血管壁。(3)逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测①在mRNA水平HPA在视网膜中动态表达变化HPA mRNA在正常发育的视网膜中即有一定水平的表达。在高氧诱导的小鼠视网膜新生血管的动物模型中,随着视网膜新生血管的生长,HPAmRNA的表达逐渐增多,并维持在较高水平,随着视网膜新生血管的消退,HPAmRNA的表达又逐渐减少。②在mRNA水平perlecan在视网膜中动态表达变化Perlecan mRNA在各个时间点与HPAmRNA有着相近的表达趋势。③在mRNA水平VEGF在视网膜中动态表达变化刚出氧箱时即生后12天,小鼠进入相对缺氧环境后,VEGF mRNA的表达开始增多,于生后13天达到高峰,并维持在较高水平,生后第17天之后VEGF mRNA的表达呈逐渐下降趋势。(4)免疫印迹法检测在不同时间点,小鼠视网膜中HPA在蛋白水平的动态变化HPA蛋白质在正常发育的小鼠视网膜中即有一定水平的表达,各个时间点表达水平相对稳定。于生后13天表达开始升高,在17天达到高峰,以后逐渐降低。2.乙酰肝素酶干扰性RNA对小鼠视网膜新生血管的影响(1)视网膜铺片伊文思蓝灌注造影2%伊文思蓝上腔静脉灌注视网膜铺片可见,正常对照组生后17天的小鼠整个视网膜血管分布呈均匀的网状结构,从视盘发出的血管规则的呈放射状向周边部走行,视网膜血管间的毛细血管交织成网状。对照质粒组、高氧对照组,视盘周围大片无灌注区,大血管不规则扩张迂曲,血管密度较高,分布紊乱,可见新生血管丛和荧光渗漏。HPAsiRNA治疗组,视盘周围无灌注区面积较高氧对照组有所减少,血管迂曲和不规则扩张有所减轻,血管密度略稀疏。(2)组织学检查及血管内皮细胞计数正常组中很少见到突破视网膜内界膜的血管内皮细胞;而对照质粒组、高氧对照组组均有大量。HPAsiRNA治疗组为6.88±2.32个:对照质粒组平均每张切片突破视网膜内界膜的血管内皮细胞计数为21.04±5.39个,高氧对照组为32.73±6.38,正常对照组为0.37±O.15。统计学分析表明,HPAsiRNA治疗组与其他各组间差别均有统计学意义(P(0.01)。(3)免疫印迹法检测HPAsiRNA治疗组较对照质粒组、高氧对照组HPA蛋白表达量明显减少;对照质粒组和高氧对照组差别亦有统计学意义(P<0.01)。结论乙酰肝素酶及其最重要的作用底物之一串珠素与视网膜新生血管的生长过程成平行关系,其可能在视网膜新生血管过程中起重要作用。靶向抑制乙酰肝素酶的表达可能为治疗视网膜新生血管性疾病提供一条新的途径。