在竞争洗脱体系中,为了确保金属螯合Cu(Ⅱ)柱在低流失率的前提下,能使蛋白质得到很好的分离,我们从螯合配基与金属Cu2+的络合稳定常数以及同一系列配体齿数对色谱特性的影响出发,筛选出同一系列的氨羧类螯合剂。此类配体是一种多功能、多用途的螯合吸附剂,既可以应用于蛋白质的离子交换色谱,金属离子的去除,又可用于蛋白质的金属螯合色谱。因此,系统的研究蛋白质在此类络合型固定相上的色谱性能,尤其是其金属螯合特性,对拓展固定金属亲和色谱(IMAC)的应用范围、应用开发前景以及市场效益,均有着十分重要的意义。基于上述思路,本文以L-谷氨酸(L-Glu)、谷氨酸-溴乙酸(Glu-BAA)、谷氨酸-溴代丁二酸(Glu-BUSA)为配基,硅胶为基质,分别合成了具有阳离子交换特性的氨羧类多齿Glu-硅胶、Glu-BAA-硅胶和Glu-BUSA-硅胶柱。利用合成的系列多齿色谱柱分析和分离了标准蛋白质混合物；并以Glu-硅胶柱为例,与目前市场上常用的亚氨基二乙酸柱(IDA)进行比较。根据填料的理化性能以及流动相pH值和盐浓度对蛋白质保留值的影响,论证了合成的三种多齿配体硅胶柱均具有离子交换的静电作用特征,并且配体的齿数对制备色谱柱的离子交换特性影响不大。此外,与传统的IDA柱相比,新筛选的Glu-硅胶配体对标准蛋白混合物的分离效果更好。将上述合成的三种多齿配体硅胶柱引入金属Cu2+后,固定相均具有金属螯合特性。在Glu-Cu(II)柱上,考察了不同固定方法、不同pH值的铜溶液对键合量及其稳定性的影响,以及固定金属离子键合密度对金属螯合柱配位作用的影响。比较了螯合配体的齿数与键合量的关系。从固定金属离子、溶液pH、盐浓度、竞争剂的种类及其浓度出发,考察了蛋白质在这三种多齿螯合Cu(Ⅱ)柱上的色谱行为以及金属Cu2+的流失情况。讨论了即能保证较低流失率又能有效分离蛋白质的最优洗脱条件。并以Glu-Cu(II)为例,与传统的IDA-Cu(II)柱进行比较,研究了配体络合稳定常数对金属螯合柱分离条件以及金属离子流失率的影响。结果表明,在pH 5.0的NaAc-HAc缓冲体系下动态法固定金属Cu2+的方法最为适宜。并且金属离子的键合量随着配体齿数的增加而增大。按照建立的色谱条件,三种多齿螯合Cu(Ⅱ)柱均能有效地分离蛋白质混合物。比较而言,齿数最大的五齿的Glu-BSUA配基是最佳螯合剂的选择。证明了蛋白质的洗脱与分离好坏与配体的齿数相关,配体的齿数对制备的金属螯合柱色谱特性有较大影响。此外,与传统IDA-Cu(II)柱相比,并非配体的络合稳定常数越高就越好,蛋白质在Glu-Cu(II)柱上的分离性能更优,金属Cu2+的流失量更小。该研究对于解决固定金属Cu2+的流失问题,减少蛋白分离纯化过程中的重金属污染,以及扩展IMAC的应用具有重要的参考价值。