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脑卒中是一种严重的医疗卫生事件，其表现为大脑血液供应不良从而进一步导致神经元细胞死亡，对人类的健康以及生活质量产生非常严重的威胁，最终导致人们致死或致残，然而目前对此疾病的有效治疗方法仍十分匮乏。组织型纤溶酶原激活剂（Alteplase，rt-PA）是目前唯一有效的治疗急性缺血性脑卒中药物。但是，该治疗方案经常受到时间窗以及溶栓禁忌症的限制，最终导致临床应用受到阻碍。因此，对脑卒中发病机制的研究及其新治疗方法的探索有着重大的理论、临床和社会意义。
血红素加氧酶（HO）是降解体内血红素的限速酶，血红素被HO氧化降解成有效的抗氧化剂一氧化碳、胆绿素和自由铁。HO有两种同工酶，即HO-1和HO-2。HO-1是人体中广泛存在的一种催化酶，具有不同的生物活性，如抗氧化，抗凋亡，降低炎症反应等。HO-1在缺血性损伤、氧化应激或其他伤害性刺激诱导下可在中枢神经系统内大量表达。研究发现基因敲除HO-1的小鼠对缺血再灌注损伤更敏感。此外，在转基因大鼠中，HO-1过表达可以有效降低由大脑中动脉闭塞（MCAO）引起的缺血性脑卒中损伤，提示HO-1在缺血性脑损伤中具有保护作用。然而目前仍缺乏有效的手段在体内高表达HO-1，腺病毒（AV）是一种有效的基因运载载体，腺病毒载体携带HO-1可能是潜在的针对缺血性脑卒中的一种新型治疗靶点。
调节性T细胞（Treg）和Th17细胞是两类CD4＋T淋巴细胞亚群。Treg细胞是近年发现的具有重要免疫反应负性调节作用的细胞，可广泛参与过敏反应、自身免疫反应、移植物抗宿主反应等多种免疫应答，通过分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β等细胞因子参与多种疾病的病理生理过程。Th17细胞主要分泌IL-17A、IL-6和IL-23等，与促进炎症反应和自身免疫性疾病相关。
HO-1在缺血性脑卒中的发病机制中作为体内重要的保护性蛋白，具有关键作用，其进入脑组织可介导免疫及非免疫反应，引发机体的氧化应激，抑制免疫反应发挥抗炎作用。研究认为T细胞介导的炎症反应在缺血性脑卒中病理过程中起重要作用，而HO-1能够降低局部组织中的炎症反应，从而减轻脑损伤。近年研究显示，缺血性脑卒中后不同亚型的CD4+T细胞在脑损伤过程中发挥不同作用，其中Treg细胞能够降低炎症反应进而保护缺血脑组织。近年来研究表明，HO-1对各种细胞的分化均有影响，如树突状细胞、脂肪细胞、成骨细胞和枯否细胞等，其中部分文章报道发现Th17细胞的分化也受HO-1表达的影响。而HO-1是否可以通过调节Treg和Th17细胞在缺血性脑损伤中发挥作用尚不清楚。
细胞因子TGF-β和IL-6是促进na?ve T细胞分化为Th17细胞所必需的细胞因子，维甲酸相关孤儿受体γt抗体（RORγt）和信号传导与转录激活因子（STAT3）是影响Th17细胞分化的主要转录因子。体外实验发现RORγt和叉头状转录因子（Foxp3）的表达受细胞因子TGF-β的调控。它能够识别na?ve T细胞表面的丝氨酸或苏氨酸激酶相关受体并与其结合，进而导致细胞内转录因子Smad2和Smad3的磷酸化，从而形成异源二聚体或三聚体进入细胞核内，最终促进RORγt和Foxp3的表达。Th17细胞表面IL-23受体表达受转录因子RORγt的调控，该细胞因子信号通路的活化能够促进Th17细胞的分化、成熟以及扩增。RORγt的高表达可使其发挥作用而促进Th17细胞分化。另外，Foxp3被认为是Treg细胞的特征性转录因子，该细胞因子的高表达后能促进Treg细胞的分化和增殖。IL-6信号通路活化是调控na?ve T细胞向Th17/Treg细胞分化的关键。研究还发现HO-1以及催化产物CO对高氧性肺内皮损伤和肝脏缺血再灌注损伤具有非常好的保护作用，其主要机制是通过活化细胞内STAT3信号通路引起的。
本研究拟通过腺病毒介导HO-1过表达，在tMCAO大鼠模型中，探讨HO-1通过调节Th17/Treg在缺血性脑卒模型中发挥的作用及其机制，为深入研究及探索临床治疗缺血性脑卒中提供依据。
目的：
1.明确腺病毒载体介导的HO-1基因过表达对大鼠局灶性脑缺血损伤的作用。
2.构建大鼠局灶性脑缺血模型，采用腺病毒介导的HO-1过表达，研究其通过体内Th17/Treg细胞对脑缺血后损伤的作用。
3.体外实验探讨HO-1调控Th17/Treg细胞分化可能的机制。
方法：
以SD大鼠为实验对象，将24只大鼠用随机数字表法随机分为四组，分别为假手术组(sham,SH组)，空载体组(vehicle，Ⅴ组)，空腺病毒载体组(adenovirus vector group，Ad组)和腺病毒HO-1转染组(Ad-HO-1)。在缺血处理前，将Ⅴ组、Ad组和Ad-HO-1组大鼠分别经侧脑室持续注射3天生理盐水、空载体腺病毒、重组HO-1腺病毒。使用短暂性大脑中动脉栓塞(tMCAO)方法构局灶性脑缺血模型。tMCAO术后24小时，采用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达量评估腺病毒感染情况，采用Western blot法检测各组大鼠HO-1表达，采用TTC法测定大鼠脑梗死的体积，采用神经功能缺损评分评价大鼠的神经系统功能缺损情况，通过测定Caspase-3活性和TUNEL法评估神经元凋亡情况。
经ELISA检测血清中细胞因子IL-17A、IL-6、IL-10含量、脑组织匀浆中IL-17A、IL-6、IL-10含量，以及脾脏细胞培养所得上清中IL-17A和IL-6的含量进行测定；经Western blot法对p-STAT3与RORγt在脑组织内表达进行测定；经Real-time PCR对脑组织内IL-10与IL-17A的mRNA表达量进行测定，经FCM法来检测Th17细胞和Treg细胞数量以及CD4+细胞IL-10R的表达量。通过以上实验对HO-1过表达干预的实施影响Th17和Treg关键细胞因子与受体状况进行全面分析。
从健康SD大鼠脾脏分离CD4+T细胞，分为四组，为Th0组（抗大鼠CD3抗体添加至培养体系内）、Th17组（在Th0组的基础上，分别将大鼠TGF-β1、IL-6、IL-23、IL-2，以及抗大鼠IL-4抗体、抗大鼠IFN-γ抗体添加至培养体系内）、Th17+Hemin组（Hemin，HO-1诱导剂）、Th17+Snpp组（Snpp，HO-1活性抑制剂）。细胞培养中添加细胞因子和相关抗体处理5d，收集细胞，用FCM法检测Th17细胞比值；用Real-time PCR法检测培养细胞的细胞因子（IL-6、IL-17A、IL-10与TGF-β）、转录因子（RORγt、Foxp3与STAT3）的mRNA水平，用ELISA法对检测细胞培养上清内IL-6、IL-10、TGF-β与IL-17A含量。统计分析采用软件GraphPad7.0，各组间各指标表达比较采用单因素方差分析。
统计学处理方法中，正态分布的连续变量均以均数±标准差(mean±SD，standard deviation)表示。实验结果中各组之间的统计方法使用t检验或ANOVA检验。实验结果中各组之间异常分布的数据使用Kruskal-Wallis ANOVA方法进行统计分析，P＜0.05被认为具有统计学意义。
结果：
1.tMCAO术后24h，Ad-HO-1组大鼠脑组织中HO-1的表达较对照组显著增加，脑梗死总体积显著降低，凋亡指数也明显下降；Ad-HO-1组脑组织中caspase-3的活化和TUNEL阳性染色的凋亡细胞明显减少。对不同组大鼠神经功能评分，发现Ad-HO-1组神经功能评分均显著高于Ad组以及Ⅴ组（9.82±0.17）。
2.Ad-HO-1感染大鼠，tMCAO造模之后，血清IL-17A蛋白含量显著低于对照组，IL-6和IL-10表达水平与对照组相比较无明显变化；脑组织中IL-17A蛋白以及mRNA的含量显著低于对照组，IL-10蛋白的表达水平高于对照组，IL-6蛋白在无差异；脾脏细胞分泌IL-17A的量低于对照组；IL-6的水平均没有明显差异。
3.Ad-HO-1感染大鼠，tMCAO造模之后，大鼠脑组织中RORγt表达水平与对照相比显著降低；p-STAT3的表达没有明显变化；CD4+T细胞中IL-10R表达与对照相比显著升高；脾脏细胞中Th17的细胞比例与对照相比显著降低；Treg细胞的比例在脾脏组织还是脑组织中与对照相比高于Ad组。
4.Hemin体外诱导的Th17细胞可上调HO-1mRNA表达水平，SnPP处理细胞后以期抑制其HO-1活性，但是mRNA表达水平没有显著性差异。Th17+Hemin组中IL-17A mRNA和蛋白水平降低，IL-6mRNA及培养上清液中IL-6蛋白水平明显减少；IL-10mRNA水平和蛋白水平均没有变化；TGF-β在mRNA水平增加，而在蛋白水平下降；RORγt、STAT3及Foxp3mRNA的水平明显下降。
结论：
1.HO-1过表达后，对脑缺血脑损伤具有神经保护作用。
2.HO-1抑制Th17细胞特异性转录因子RORγt的表达，进而抑制Th17细胞分化，从而下调Th17细胞中IL-17A的分泌，最终发挥拮抗MCAO缺血损伤的作用。
3.HO-1促进Treg细胞分化，并上调IL-10R的表达，重设机体Th细胞免疫平衡。
血红素加氧酶（HO）是降解体内血红素的限速酶，血红素被HO氧化降解成有效的抗氧化剂一氧化碳、胆绿素和自由铁。HO有两种同工酶，即HO-1和HO-2。HO-1是人体中广泛存在的一种催化酶，具有不同的生物活性，如抗氧化，抗凋亡，降低炎症反应等。HO-1在缺血性损伤、氧化应激或其他伤害性刺激诱导下可在中枢神经系统内大量表达。研究发现基因敲除HO-1的小鼠对缺血再灌注损伤更敏感。此外，在转基因大鼠中，HO-1过表达可以有效降低由大脑中动脉闭塞（MCAO）引起的缺血性脑卒中损伤，提示HO-1在缺血性脑损伤中具有保护作用。然而目前仍缺乏有效的手段在体内高表达HO-1，腺病毒（AV）是一种有效的基因运载载体，腺病毒载体携带HO-1可能是潜在的针对缺血性脑卒中的一种新型治疗靶点。
调节性T细胞（Treg）和Th17细胞是两类CD4＋T淋巴细胞亚群。Treg细胞是近年发现的具有重要免疫反应负性调节作用的细胞，可广泛参与过敏反应、自身免疫反应、移植物抗宿主反应等多种免疫应答，通过分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β等细胞因子参与多种疾病的病理生理过程。Th17细胞主要分泌IL-17A、IL-6和IL-23等，与促进炎症反应和自身免疫性疾病相关。
HO-1在缺血性脑卒中的发病机制中作为体内重要的保护性蛋白，具有关键作用，其进入脑组织可介导免疫及非免疫反应，引发机体的氧化应激，抑制免疫反应发挥抗炎作用。研究认为T细胞介导的炎症反应在缺血性脑卒中病理过程中起重要作用，而HO-1能够降低局部组织中的炎症反应，从而减轻脑损伤。近年研究显示，缺血性脑卒中后不同亚型的CD4+T细胞在脑损伤过程中发挥不同作用，其中Treg细胞能够降低炎症反应进而保护缺血脑组织。近年来研究表明，HO-1对各种细胞的分化均有影响，如树突状细胞、脂肪细胞、成骨细胞和枯否细胞等，其中部分文章报道发现Th17细胞的分化也受HO-1表达的影响。而HO-1是否可以通过调节Treg和Th17细胞在缺血性脑损伤中发挥作用尚不清楚。
细胞因子TGF-β和IL-6是促进na?ve T细胞分化为Th17细胞所必需的细胞因子，维甲酸相关孤儿受体γt抗体（RORγt）和信号传导与转录激活因子（STAT3）是影响Th17细胞分化的主要转录因子。体外实验发现RORγt和叉头状转录因子（Foxp3）的表达受细胞因子TGF-β的调控。它能够识别na?ve T细胞表面的丝氨酸或苏氨酸激酶相关受体并与其结合，进而导致细胞内转录因子Smad2和Smad3的磷酸化，从而形成异源二聚体或三聚体进入细胞核内，最终促进RORγt和Foxp3的表达。Th17细胞表面IL-23受体表达受转录因子RORγt的调控，该细胞因子信号通路的活化能够促进Th17细胞的分化、成熟以及扩增。RORγt的高表达可使其发挥作用而促进Th17细胞分化。另外，Foxp3被认为是Treg细胞的特征性转录因子，该细胞因子的高表达后能促进Treg细胞的分化和增殖。IL-6信号通路活化是调控na?ve T细胞向Th17/Treg细胞分化的关键。研究还发现HO-1以及催化产物CO对高氧性肺内皮损伤和肝脏缺血再灌注损伤具有非常好的保护作用，其主要机制是通过活化细胞内STAT3信号通路引起的。
本研究拟通过腺病毒介导HO-1过表达，在tMCAO大鼠模型中，探讨HO-1通过调节Th17/Treg在缺血性脑卒模型中发挥的作用及其机制，为深入研究及探索临床治疗缺血性脑卒中提供依据。
目的：
1.明确腺病毒载体介导的HO-1基因过表达对大鼠局灶性脑缺血损伤的作用。
2.构建大鼠局灶性脑缺血模型，采用腺病毒介导的HO-1过表达，研究其通过体内Th17/Treg细胞对脑缺血后损伤的作用。
3.体外实验探讨HO-1调控Th17/Treg细胞分化可能的机制。
方法：
以SD大鼠为实验对象，将24只大鼠用随机数字表法随机分为四组，分别为假手术组(sham,SH组)，空载体组(vehicle，Ⅴ组)，空腺病毒载体组(adenovirus vector group，Ad组)和腺病毒HO-1转染组(Ad-HO-1)。在缺血处理前，将Ⅴ组、Ad组和Ad-HO-1组大鼠分别经侧脑室持续注射3天生理盐水、空载体腺病毒、重组HO-1腺病毒。使用短暂性大脑中动脉栓塞(tMCAO)方法构局灶性脑缺血模型。tMCAO术后24小时，采用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达量评估腺病毒感染情况，采用Western blot法检测各组大鼠HO-1表达，采用TTC法测定大鼠脑梗死的体积，采用神经功能缺损评分评价大鼠的神经系统功能缺损情况，通过测定Caspase-3活性和TUNEL法评估神经元凋亡情况。
经ELISA检测血清中细胞因子IL-17A、IL-6、IL-10含量、脑组织匀浆中IL-17A、IL-6、IL-10含量，以及脾脏细胞培养所得上清中IL-17A和IL-6的含量进行测定；经Western blot法对p-STAT3与RORγt在脑组织内表达进行测定；经Real-time PCR对脑组织内IL-10与IL-17A的mRNA表达量进行测定，经FCM法来检测Th17细胞和Treg细胞数量以及CD4+细胞IL-10R的表达量。通过以上实验对HO-1过表达干预的实施影响Th17和Treg关键细胞因子与受体状况进行全面分析。
从健康SD大鼠脾脏分离CD4+T细胞，分为四组，为Th0组（抗大鼠CD3抗体添加至培养体系内）、Th17组（在Th0组的基础上，分别将大鼠TGF-β1、IL-6、IL-23、IL-2，以及抗大鼠IL-4抗体、抗大鼠IFN-γ抗体添加至培养体系内）、Th17+Hemin组（Hemin，HO-1诱导剂）、Th17+Snpp组（Snpp，HO-1活性抑制剂）。细胞培养中添加细胞因子和相关抗体处理5d，收集细胞，用FCM法检测Th17细胞比值；用Real-time PCR法检测培养细胞的细胞因子（IL-6、IL-17A、IL-10与TGF-β）、转录因子（RORγt、Foxp3与STAT3）的mRNA水平，用ELISA法对检测细胞培养上清内IL-6、IL-10、TGF-β与IL-17A含量。统计分析采用软件GraphPad7.0，各组间各指标表达比较采用单因素方差分析。
统计学处理方法中，正态分布的连续变量均以均数±标准差(mean±SD，standard deviation)表示。实验结果中各组之间的统计方法使用t检验或ANOVA检验。实验结果中各组之间异常分布的数据使用Kruskal-Wallis ANOVA方法进行统计分析，P＜0.05被认为具有统计学意义。
结果：
1.tMCAO术后24h，Ad-HO-1组大鼠脑组织中HO-1的表达较对照组显著增加，脑梗死总体积显著降低，凋亡指数也明显下降；Ad-HO-1组脑组织中caspase-3的活化和TUNEL阳性染色的凋亡细胞明显减少。对不同组大鼠神经功能评分，发现Ad-HO-1组神经功能评分均显著高于Ad组以及Ⅴ组（9.82±0.17）。
2.Ad-HO-1感染大鼠，tMCAO造模之后，血清IL-17A蛋白含量显著低于对照组，IL-6和IL-10表达水平与对照组相比较无明显变化；脑组织中IL-17A蛋白以及mRNA的含量显著低于对照组，IL-10蛋白的表达水平高于对照组，IL-6蛋白在无差异；脾脏细胞分泌IL-17A的量低于对照组；IL-6的水平均没有明显差异。
3.Ad-HO-1感染大鼠，tMCAO造模之后，大鼠脑组织中RORγt表达水平与对照相比显著降低；p-STAT3的表达没有明显变化；CD4+T细胞中IL-10R表达与对照相比显著升高；脾脏细胞中Th17的细胞比例与对照相比显著降低；Treg细胞的比例在脾脏组织还是脑组织中与对照相比高于Ad组。
4.Hemin体外诱导的Th17细胞可上调HO-1mRNA表达水平，SnPP处理细胞后以期抑制其HO-1活性，但是mRNA表达水平没有显著性差异。Th17+Hemin组中IL-17A mRNA和蛋白水平降低，IL-6mRNA及培养上清液中IL-6蛋白水平明显减少；IL-10mRNA水平和蛋白水平均没有变化；TGF-β在mRNA水平增加，而在蛋白水平下降；RORγt、STAT3及Foxp3mRNA的水平明显下降。
结论：
1.HO-1过表达后，对脑缺血脑损伤具有神经保护作用。
2.HO-1抑制Th17细胞特异性转录因子RORγt的表达，进而抑制Th17细胞分化，从而下调Th17细胞中IL-17A的分泌，最终发挥拮抗MCAO缺血损伤的作用。
3.HO-1促进Treg细胞分化，并上调IL-10R的表达，重设机体Th细胞免疫平衡。