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吸烟与多种肿瘤的发生及预后有关，我们临床研究发现吸烟与宫颈癌转移有关，但机制不明。进一步前期研究显示烟草代谢产物NNK可影响CAFs中DKK3表达，而DKK3是Wnt信号的抑制因子，与肿瘤转移有关。由此推测NNK能影响微环境中DKK3含量，激活宫颈癌细胞Wnt信号，诱导EMT。为此，本研究利用原代细胞培养、分子生物学及蛋白质组学等技术，解析NNK对CAFs中DKK3基因的转录调控及其旁分泌调节癌细胞Wnt信号通路的机制，揭示“NNK-CAFs/DKK3-宫颈癌细胞/Wnt信号-EMT”之间的调控关系，进一步探究NNK促进宫颈癌转移的机理，为宫颈癌防治及干预提供理论依据。
第一部分CAFs细胞的分离鉴定
目的：体外原代培养获取较高纯度的宫颈癌相关成纤维细胞(CAFs)。
方法：取确诊为宫颈癌患者的新鲜组织标本，Ⅰ型胶原酶消化后进行原代培养，观察细胞生长状况并运用胰酶消化及反复贴壁进行细胞纯化；细胞免疫荧光用于鉴定体外原代培养的宫颈癌相关成纤维细胞的纯度。
结果：优化培养条件后从人宫颈癌组织中成功分离出CAFs，细胞呈栅栏样放射生长，十代内的CAFs形态基本一致，经免疫荧光鉴定，CAFs细胞中波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色阳性，角蛋白-19(CK-19)染色呈阴性。
结论：本研究成功培养出较高纯度的的宫颈癌相关成纤维细胞，为后期探讨CAFs在宫颈癌肿瘤细胞侵袭转移行为中的作用奠定基础。
第二部分NNK和CAFs对宫颈癌细胞侵袭转移的影响
目的：探究NNK和CAFs联合作用对宫颈癌细胞侵袭和迁移的影响。
方法：实验组为CAFs和宫颈癌细胞系Siha共培养模拟肿瘤微环境，并利用尼古丁代谢衍生物NNK处理共培体系或单独处理Siha细胞，无处理Siha组为空白对照。细胞划痕实验、transwell迁移实验和侵袭实验研究肿瘤细胞侵袭迁移的程度。
结果：相较于空白组，NNK处理后的两组肿瘤细胞的迁移和侵袭能力更强，而NNK和CAFs共同作用于宫颈癌细胞后肿瘤细胞迁移侵袭数量高于NNK单独影响肿瘤细胞。
结论：宫颈癌细胞的侵袭和迁移行为是由NNK和微环境中CAFs共同作用而促成的。
第三部分NNK对CCAFs中DKK3蛋白表达的转录调控机制及对旁分泌的影响
目的：明确NNK对宫颈癌相关成纤维细胞(CAFs)中DKK3转录表达的调节作用及其对旁分泌的影响。
方法：NNK处理CAFs/Siha共培体系，实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测CAFs细胞中DKK3、DNMT1、AKTmRNA表达丰度，蛋白印迹(Western blotting)分析相应的蛋白表达水平。DKK3基因甲基化程度和旁分泌表达分别利用甲基化特异性PCR(MSP)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测，免疫荧光验证AKT和DNMT1在细胞内定位关系。
结果：不同浓度NNK处理后CAFs中DKK3蛋白表达及mRNA水平均明显下降，同时DNMT1的蛋白表达上调，其mRNA丰度呈上升趋势但无显著差异。对共培体系加用DNMT1抑制剂MK并作用48h后发现，CAFs中DKK3mRNA及其蛋白表达均较处理前增加。同时，MSP结果提示，NNK作用后DKK3CpG岛发生甲基化，且在DNMT1抑制剂的作用下能部分逆转其甲基化程度。此外，NNK处理后，CAFs中DNMT1和p-AKT1蛋白表达一致上调，同时在AKT抑制剂SGI的处理下二者基因和蛋白水平均明显下降。对共培养后的CAFs进行免疫荧光检测，发现SGI能明显抑制细胞内DNMT1的表达，且AKT1与DNMT1均在细胞核内高表达，二者胞内定位一致。NNK作用于CAFs/Siha体系后，细胞上清液中DKK3含量明显下降，且胞浆内DKK3表达也逐渐降低。
结论：NNK通过激活CAFs中的AKT酶活性，促进DNMT1在细胞中的聚集，诱导DKK3CpG岛甲基化，抑制DKK3的表达及旁分泌，从而下调微环境中DKK3的含量。
第四部分DKK3调节宫颈癌细胞Wnt信号途径诱导EMT的机制
目的：研究DKK3调节宫颈癌细胞中Wnt信号传导的途径并探讨其可能机制。
方法：质粒转染宫颈癌细胞后利用免疫共沉淀(Co-IP)和下拉法(Pull-down)检测DKK3和Krm1/2相互作用，WB明确LRP6及Wnt通路和EMT标志蛋白变化，明胶酶谱检测MMP2活性。免疫荧光观察β-catenin蛋白在胞浆内的分布变化。
结果：Flag-Krm1及Flag-Krm2质粒分别转染入宫颈癌Siha细胞中培养后提取细胞蛋白，同时构建并表达纯化的GST-DKK3蛋白，两组蛋白在体外进行Pull-Down蛋白捕获实验，GST-DKK3能在体外拉下Krm1与Krm2。此外，Co-IP技术分析，经双向免疫沉淀后带标签的DKK3与Krm1/2可以在宫颈癌细胞内相互作用并形成蛋白结合体。DKK3过表达及干扰质粒转染入Siha细胞后与CAFs共同培养，共培后的Siha细胞中LRP6基因和蛋白水平均发生不同程度的改变，DKK3过表达后，细胞膜蛋白LRP6表达下调，而干扰组的表达上调。宫颈癌细胞转染质粒或NNK处理共培体系，结果提示，Wnt通路中β-catenin和下游靶基因Snail随NNK剂量的增大、DKK3表达的降低而上调蛋白表达。免疫荧光测定显示，随着NNK剂量的改变，通路信号中的β-catenin在细胞质中分布增加，且DKK3过表达后胞核、胞质中的β-catenin表达下降，干扰DKK3后表达上升。NNK处理或干扰DKK3后宫颈癌细胞中E-钙粘素表达下降，N-钙黏素和Vimentin蛋白表达上调，过表达DKK3蛋白表达趋势改变，免疫印迹和明胶酶谱分析，发现DKK3下降后MMP-2、MMP-9的含量和活性增强。
结论：DKK3与Krm蛋白相互作用后与LRP6结合形成三聚体，激活宫颈癌细胞Wnt信号通路，诱导EMT，促进宫颈癌细胞的转移。
第一部分CAFs细胞的分离鉴定
目的：体外原代培养获取较高纯度的宫颈癌相关成纤维细胞(CAFs)。
方法：取确诊为宫颈癌患者的新鲜组织标本，Ⅰ型胶原酶消化后进行原代培养，观察细胞生长状况并运用胰酶消化及反复贴壁进行细胞纯化；细胞免疫荧光用于鉴定体外原代培养的宫颈癌相关成纤维细胞的纯度。
结果：优化培养条件后从人宫颈癌组织中成功分离出CAFs，细胞呈栅栏样放射生长，十代内的CAFs形态基本一致，经免疫荧光鉴定，CAFs细胞中波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色阳性，角蛋白-19(CK-19)染色呈阴性。
结论：本研究成功培养出较高纯度的的宫颈癌相关成纤维细胞，为后期探讨CAFs在宫颈癌肿瘤细胞侵袭转移行为中的作用奠定基础。
第二部分NNK和CAFs对宫颈癌细胞侵袭转移的影响
目的：探究NNK和CAFs联合作用对宫颈癌细胞侵袭和迁移的影响。
方法：实验组为CAFs和宫颈癌细胞系Siha共培养模拟肿瘤微环境，并利用尼古丁代谢衍生物NNK处理共培体系或单独处理Siha细胞，无处理Siha组为空白对照。细胞划痕实验、transwell迁移实验和侵袭实验研究肿瘤细胞侵袭迁移的程度。
结果：相较于空白组，NNK处理后的两组肿瘤细胞的迁移和侵袭能力更强，而NNK和CAFs共同作用于宫颈癌细胞后肿瘤细胞迁移侵袭数量高于NNK单独影响肿瘤细胞。
结论：宫颈癌细胞的侵袭和迁移行为是由NNK和微环境中CAFs共同作用而促成的。
第三部分NNK对CCAFs中DKK3蛋白表达的转录调控机制及对旁分泌的影响
目的：明确NNK对宫颈癌相关成纤维细胞(CAFs)中DKK3转录表达的调节作用及其对旁分泌的影响。
方法：NNK处理CAFs/Siha共培体系，实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测CAFs细胞中DKK3、DNMT1、AKTmRNA表达丰度，蛋白印迹(Western blotting)分析相应的蛋白表达水平。DKK3基因甲基化程度和旁分泌表达分别利用甲基化特异性PCR(MSP)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测，免疫荧光验证AKT和DNMT1在细胞内定位关系。
结果：不同浓度NNK处理后CAFs中DKK3蛋白表达及mRNA水平均明显下降，同时DNMT1的蛋白表达上调，其mRNA丰度呈上升趋势但无显著差异。对共培体系加用DNMT1抑制剂MK并作用48h后发现，CAFs中DKK3mRNA及其蛋白表达均较处理前增加。同时，MSP结果提示，NNK作用后DKK3CpG岛发生甲基化，且在DNMT1抑制剂的作用下能部分逆转其甲基化程度。此外，NNK处理后，CAFs中DNMT1和p-AKT1蛋白表达一致上调，同时在AKT抑制剂SGI的处理下二者基因和蛋白水平均明显下降。对共培养后的CAFs进行免疫荧光检测，发现SGI能明显抑制细胞内DNMT1的表达，且AKT1与DNMT1均在细胞核内高表达，二者胞内定位一致。NNK作用于CAFs/Siha体系后，细胞上清液中DKK3含量明显下降，且胞浆内DKK3表达也逐渐降低。
结论：NNK通过激活CAFs中的AKT酶活性，促进DNMT1在细胞中的聚集，诱导DKK3CpG岛甲基化，抑制DKK3的表达及旁分泌，从而下调微环境中DKK3的含量。
第四部分DKK3调节宫颈癌细胞Wnt信号途径诱导EMT的机制
目的：研究DKK3调节宫颈癌细胞中Wnt信号传导的途径并探讨其可能机制。
方法：质粒转染宫颈癌细胞后利用免疫共沉淀(Co-IP)和下拉法(Pull-down)检测DKK3和Krm1/2相互作用，WB明确LRP6及Wnt通路和EMT标志蛋白变化，明胶酶谱检测MMP2活性。免疫荧光观察β-catenin蛋白在胞浆内的分布变化。
结果：Flag-Krm1及Flag-Krm2质粒分别转染入宫颈癌Siha细胞中培养后提取细胞蛋白，同时构建并表达纯化的GST-DKK3蛋白，两组蛋白在体外进行Pull-Down蛋白捕获实验，GST-DKK3能在体外拉下Krm1与Krm2。此外，Co-IP技术分析，经双向免疫沉淀后带标签的DKK3与Krm1/2可以在宫颈癌细胞内相互作用并形成蛋白结合体。DKK3过表达及干扰质粒转染入Siha细胞后与CAFs共同培养，共培后的Siha细胞中LRP6基因和蛋白水平均发生不同程度的改变，DKK3过表达后，细胞膜蛋白LRP6表达下调，而干扰组的表达上调。宫颈癌细胞转染质粒或NNK处理共培体系，结果提示，Wnt通路中β-catenin和下游靶基因Snail随NNK剂量的增大、DKK3表达的降低而上调蛋白表达。免疫荧光测定显示，随着NNK剂量的改变，通路信号中的β-catenin在细胞质中分布增加，且DKK3过表达后胞核、胞质中的β-catenin表达下降，干扰DKK3后表达上升。NNK处理或干扰DKK3后宫颈癌细胞中E-钙粘素表达下降，N-钙黏素和Vimentin蛋白表达上调，过表达DKK3蛋白表达趋势改变，免疫印迹和明胶酶谱分析，发现DKK3下降后MMP-2、MMP-9的含量和活性增强。
结论：DKK3与Krm蛋白相互作用后与LRP6结合形成三聚体，激活宫颈癌细胞Wnt信号通路，诱导EMT，促进宫颈癌细胞的转移。