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目前随着车祸等交通事故的增多,高能量创伤可造成多发性或粉碎性骨折,周围血管、软组织的严重损伤等复合伤,以上改变导致断端骨质缺损、血供差,机械稳定性差,增加了骨不连的发生率。目前临床治疗采用的各种方法,如体外冲击波、自体骨移植等手术或非手术方法,虽然临床应用的适应症不同,但均以恢复患肢功能,矫正畸形,提高生活质量为目的。其中机械应力刺激对于骨折愈合起着至关重要的作用。实验研究表明应力刺激可主导骨小梁的形态和分布,也能刺激骨折局部的成骨因子的高表达。因此本实验欲研究应力刺激对骨不连愈合的影响,首先建立骨不连模型,待模型建成后,对骨不连段端加压,测定加压前后断端间的主要成骨因子(BMP、VEGF、TGF)的变化,并观察影像学和组织学改变,为机械性应力作用于骨不连断端促进骨折愈合提供相应的理论依据。主要实验方法及结果1骨不连模型建立所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉,术前肌注庆大霉素1mL。剃除右后肢毛发,手术区碘伏消毒,铺无菌单,以股骨中段为中心,做纵行切口(与股骨长轴平行),依次切开皮肤、筋膜,钝性分离至股骨表面,尽量保留骨膜,充分暴露股骨,自小转子与第三转子之间依次钻孔,拧入两枚螺纹钉,自股骨髁远端向近端方向,依次钻孔、拧入两枚螺纹钉,中间两组螺丝钉之间用磨钻截断,将四根螺丝钉套入加压式外固定架,调整断端距离d=6mm,拧紧外固定支架,用生理盐水冲洗断端髓腔,逐层缝合伤口。术后5天肌注庆大霉素(1mL／只),预防感染。1.1X线检查：在0、2、4、6、8、10、12周连续影像学显示骨折线仍清晰可见,无连续性骨痂形成；术后12周时观察到断端间无骨桥形成,断端髓腔骨性封闭,呈杵棒样改变；外固定支架稳定,断端保持在同一水平面上。1.2骨组织的HE染色：术后2周断端周围少量细胞核深染的成骨样细胞,周围有大量的炎症反应细胞；术后4周,断端周围成骨样细胞增多,并出现一定数量的软骨细胞,断端之间充满大量炎性细胞；术后8周,断端周围有少量细胞核深染的成骨样细胞及大量肥大软骨样细胞和成纤维细胞；术后10周,断端出现大量不规则的编织样骨；术后12周,断端髓腔骨性封闭,周围见少量成骨细胞,断端见大量结缔组织。2骨不连模型断端机械应力实验实验组：螺帽1有固定滑块2的作用,以维持滑块2与3之间的固定距离。在加压的第1个月,通过卡尺计量调节螺旋杆,缩短2mm的距离,每天通过食物刺激的方法诱使大鼠高强度活动。每次持续10min,间歇30min。加压的第2个、第3个月,均在原来基础上缩短2mm,加压方法同前所述。对照组：调节螺帽1,固定滑块2,维持2、3之间的距离在三个加压时间点内保持不变(d=6mm),其它方法同上所述。2.1X线检查加压后4周,断端骨折线模糊样改变,部分钉道周围骨膜下有新骨形成；8周后断端间隙呈絮状改变,单侧皮质间有新骨形成；12周时断端间隙缩短,出现一侧的骨性连接,或明显的成骨反应。2.2组织免疫组化染色对照组：在4、8、12周时骨不连断端BMP、VEGF、TGF β仍有表达,但无峰值变化,呈低表达状态。(1)BMP：加压4周后局部BMP阳性表达数量明显增高,以骨髓近端变化明显,变化量有统计学差异(p<0.05)；8周后近髓腔端的阳性表达增多,断端间出现BMP阳性表达,数量较近端少,较对照组多,与加压4周、对照组相比,数量变化有统计学差异(p<0.05)；12周后断端间BMP阳性表达有所下降,但高于对照组,与加压8周、对照组比较,变化量有统计学差异(p<0.05)。(2)VEGF：加压4周后断端间阳性表达数量明显增高,与对照组相比,变化量有统计学差异(p<0.05)；8周、12周表达量有所下降,但高于对照组,有统计学差异；加压4周时表达量出现峰值,较后两次加压的测量值变化有统计学差异(p<0.05)。(3)TGF-β：加压4周后断端间有均匀分布的阳性表达,与对照组相比,变化量有统计学差异(p<0.05)；8周、12周后表达量有所下降,均高于对照组,有统计学差异(p<0.05)；实验组不同时间段间的变化无统计学差异(p>0.05)；2.3碱性磷酸酶钙钴法染色：对照组：在4、8、12周骨不连断端仍有一定数量的成骨细胞表达,但其数量较少。实验组：加压4周后局部成骨细胞数量明显增多,较对照组变化明显(p<0.05),第8周时呈上升趋势,与前后两个时期比较统计学差异明显(p<0.05)；到12周时,成骨细胞数量降低。结论1.通过自制可调式外固定支架,可建立成熟的骨不连模型。2.骨不连局部存在低表达的成骨因子,机械应力的刺激可增加其表达。3.机械应力作用可刺激骨不连断端成骨细胞数量的增多,并有效促进断端的成骨促进愈合。创新性和意义1.本实验证明骨不连局部的成骨因子呈低表达状态,外界刺激可促使其高表达。2.机械应力刺激可增加骨不连断端成骨因子(BMP、TGF-β、VEGF)的表达,利于骨不连的愈合,为机械应力促进骨折愈合提供可靠的理论依据。