黄酒酿造中黄酒酵母与黄曲霉的定量分析及相互作用研究

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微生物的相互作用在自然界中广泛存在,尤其是在发酵食品中这种相互作用对微生物的生长和风味物质的形成具有重要的影响。在黄酒机械化生产中,通常会添加纯种黄曲霉(Aspergillus flavus)强化熟麦曲和纯种黄酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)强化酒母,这使得黄酒酵母和黄曲霉成为黄酒酿造的核心微生物,但这两株菌间的互作研究较少,不清楚其互作机制。本论文为探究黄酒酵母与黄曲霉的相互作用及影响,结合传统培养方法和现代分子生物学手段对黄酒酿造过程中黄酒酵母与黄曲霉的消长规律进行分析,解析了发酵过程中可能影响微生物演替的因素,并进一步探究了黄酒酵母与黄曲霉SU-16的互作类型及互作机制,有望为黄酒酿造提供一定的理论指导。主要研究结果如下:(1)建立了适用于微生物复杂的黄酒酿造体系的荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q PCR)方法,准确定量黄酒酿造过程中总真菌、黄酒酵母与黄曲霉的动态变化,结果显示所筛选得到的引物专一性良好,该方法定量准确性在90%以上,总真菌、黄酒酵母和黄曲霉在发酵过程中呈现先增后降的变化趋势,同时发现了黄曲霉在黄酒酿造中的变化新规律。黄酒酵母生物量在发酵0 h~48 h快速增加,发酵24 h内由4.18×10~5 CFU·g-1快速增殖到3.96×10~7 CFU·g-1,48 h时达到最大值5.90×10~7 CFU·g-1,然后开始缓慢减少,发酵结束时黄酒酵母占总真菌的94%;黄曲霉生物量在0 h~24 h内变化最大,48 h时增殖到7.49×10~5 CFU·g-1,生物量达到最高,之后呈波动下降趋势,发酵结束时生物量降低至2.35×10~4 CFU·g-1,低于初始接种量,且占总真菌含量不足1%,推测发酵环境不利于黄曲霉的生长。(2)分析黄酒酿造过程中的主要物质形成规律,并解析影响微生物变化的关键因素。对5种理化指标和66种风味物质的动态变化进行检测,结果显示主要物质形成发生在前酵过程中;对理化指标及风味物质的变化与黄酒酵母和黄曲霉的变化进行相关性分析,发现理化指标中乙醇和总酸与S.cerevisiae和A.flavus的关系密切,乙醇和总酸与S.cerevisiae的变化成正相关,与A.flavus的变化成负相关;同时发现S.cerevisiae与醇类物质呈显著正相关(R~2=0.37),A.flavus与醇类(R~2=0.51)和酸类(R~2=0.32)物质呈显著负相关,醇类和酸类物质可能是主导黄酒酵母和黄曲霉演替的主要影响因素。(3)探究了S.cerevisiae HJ和A.flavus SU-16间的互作关系及互作机制,将HJ和SU-16进行混合发酵,发现在摇瓶培养、间歇摇瓶培养和不同接种比例条件下,SU-16的生长均受到抑制作用。进一步的研究表明HJ胞外代谢产物乙醇和有机酸的分泌会对SU-16的生长产生抑制作用,当乙醇含量3%vol,乳酸含量2 g·L-1以及乙酸含量2 g·L-1时即对SU-16的生长产生显著的抑制作用(P<0.05),这也证实了发酵环境中醇类和酸类物质与A.flavus的变化呈负相关,不利于A.flavus的生长。(4)发现A.flavus SU-16的添加可促进S.cerevisiae HJ的生长繁殖、发酵速率(耗糖和产酒精),提高醪液中的氮源水平,因此在落料时分别添加0%、0.1%、0.2%、0.4%和0.6%的菌丝体(黄曲霉SU-16菌丝体占原料米的比例)以及0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.8%和3%的熟麦曲(黄曲霉SU-16熟麦曲占原料米的比例)进行发酵,结果表明,菌丝体可能通过自溶为发酵醪提供生物大分子物质,其中菌丝添加量<0.6%时既不影响发酵品质又可显著加速HJ的生长繁殖和发酵速率,显著提高HJ的产酯能力;熟麦曲的添加量与发酵醪液中氨基态氮的含量成正比,熟麦曲可以促进了黄酒酵母对氮源的吸收和利用,从而增强了风味物质的形成。综上,针对黄酒微生物共酵机理不明,黄酒酿造核心微生物(黄酒酵母和黄曲霉)研究缺乏,本论文探究了发酵过程中黄酒酵母和黄曲霉的消长规律,发现了黄曲霉在黄酒酿造中生长受到抑制的现象,通过探究黄酒酿造过程中黄酒酵母与黄曲霉的相互作用,阐明了影响黄曲霉生长的关键因素,初步明确了这两株菌的互作机制,在此基础上探究了黄曲霉对黄酒酵母及黄酒酿造的影响,从而为黄酒的酿造提供一定的指导,具有重要的科学意义与应用价值。
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