临床研究发现,二次术后患者疼痛视觉模拟评分（visual analogue scale,VAS）比第一次术后高,且术后镇痛药物量用量也增加。瑞芬太尼是临床广泛应用的超短效μ阿片类镇痛药。它具有起效快、代谢快、体内无蓄积的特点,但其诱发术后痛觉过敏的程度较其它中长效阿片类药更加严重。应用瑞芬太尼麻醉对二次术后疼痛的影响需要明确,以减少患者因痛觉过敏所致不良影响,促进术后恢复。目前多项研究发现,GluA1膜上位参与瑞芬太尼痛觉过敏,但是GluA1膜上位的调节机制目前尚未明确。Shank3蛋白是一种突触后的含PDZ域的多域支架蛋白,可以结合多重突触后蛋白,成为突触后的装配平台（assembly platform）。AMPA受体GluA1亚基通过其羧基末端PDZ结合基序直接与Shank3的PDZ域结合,参与神经发育过程中GluA1的膜转运。突触可塑性改变是中枢敏化导致痛觉敏过敏的基础。Kalirin-7是位于兴奋性突触后的一种多功能鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors,GEF）,它的特点是可以与谷氨酸受体相互作用并具有动态调节神经细胞骨架的能力。脊髓表达的Kalilin-7对于持续痛觉活动依赖性突触的长时程增强以及脊髓背角突触的活动依赖性重构是必需的。本研究拟对Sprague Dawley（SD）大鼠短期内连续两次应用瑞芬太尼麻醉实施Brennan切口术,观察瑞芬太尼对连续两次手术后疼痛的影响,并试图探索其脊髓水平发生的分子机制。第一部分大鼠第一次和第二次切口术后疼痛比较及瑞芬太尼对其影响目的:比较大鼠第一次和第二次切口术后疼痛及瑞芬太尼对其影响。方法:雄性SD大鼠经历两次设定条件处理,两次处理时间间隔为8天。设定处理条件为,NS（生理盐水）:假手术,0.1 mL/（kg·min）速率静脉输注生理盐水60min;I（incision）:行Brennan切口痛手术;R（remifentanil）:以1μg/（kg·min）速率静脉输注瑞芬太尼60 min;IR（incision+remifentanil）:进行Brennan切口痛手术,同时以1μg/（kg·min）速率静脉输注瑞芬太尼60 min。根据两次处理条件不同,大鼠分为6组（N=48,n=8）:（1）对照（Control）组:NS&NS;（2）I&I组;（3）IR&NS组;（4）IR&I组;（5）IR&R组;（6）IR&IR组。“&”符号前后表示两次处理条件。在处理前测量基线值,于第一次处理后2小时（h）、6h、1天（d）、2d、3d、5d、8d和二次处理后2h、6h、1d、2d、3d、7d、14d、18d测量大鼠机械痛阈值（PWT）和热痛阈值（PWL）。观察各组大鼠在两次处理后痛阈的变化。结果:I&I组PWT和PWL在第一次术后5天恢复到基线水平,第二次术后7天恢复到基线水平。I&I组第二次术后PWT和PWL最低值与第一次术后PWT和PWL最低值比较降低（P<0.05）。与I&I组相比,IR&I组、IR&R组和IR&IR组的PWT和PWL在第一次和第二次处理后均下降（P<0.05）。IR&IR组第二次给药后6h与第一次给药后6h PWT和PWL比较降低（P<0.05）;第一次给药后PWT和PWL最低值出现在第2天,第二次给药后PWT和PWL最低值出现在第1天,第二次给药后痛敏高峰提前;第二次给药后PWT和PWL最低值与第一次给药后PWT和PWL最低值比较降低（P<0.05）。结论:二次术后疼痛比第一次严重。瑞芬太尼加重二次术后疼痛,诱发二次痛觉过敏。第二部分瑞芬太尼诱发二次术后痛敏大鼠脊髓背角GluA1膜转运对神经元可塑性影响目的:观察瑞芬太尼诱发二次术后痛敏大鼠脊髓背角GluA1表达以及神经元结构和功能可塑性变化,并探究GluA1表达变化对瑞芬太尼诱发二次术后痛敏的影响。方法:本部分Control组、IR&NS组、IR&I组、IR&R组和IR&IR组大鼠处理同第一部分。一、1)IR&IR大鼠第二次静脉给药后2h、6h、1d、3d、7d、14d、18d取L₄-L₆脊髓背角（每个时间点n=8）,Western Blot（WB）法测定GluA1膜转位水平。2)WB法检测Control组、IR&NS组、IR&I组、IR&R组和IR&IR组（N=40,n=8）第二次静脉给药（包括生理盐水和瑞芬太尼）后1天大鼠脊髓背角GluA1膜转位水平。3)Control组和IR&IR组第二次静脉给药后1天,观察大鼠高频刺激（HFS）后脊髓背角C纤维诱发场电位的变化,另外利用高尔基染色观察L₄-L₆脊髓背角神经元形态变化和膜片钳实验观察L₄-L₆脊髓背角神经元AMPA受体介导的微小兴奋性突触后电流（mEPSC）。二、雄性SD大鼠,随机分为4组（N=32,n=8）:（1）Control组;（2）IR&IR组;（3）NASPM组:由鞘内给予大鼠AMPA受体抑制剂—NASPM;（4）IR&IR+NASPM组:大鼠经历同IR&IR组相同的处理,并于二次输注瑞芬太尼前经鞘内给予NASPM。1)处理前后测量各组大鼠PWT和PWL。2)IR&IR组和IR&IR+NASPM组大鼠在第二次静脉给药后1天,应用WB法检测L₄-L₆脊髓背角GluA1膜转位水平,观察大鼠HFS后脊髓背角C纤维诱发场电位的变化,和高尔基染色观察L₄-L₆脊髓背角神经元形态,以及膜片钳实验观察L₄-L₆脊髓背角AMPA受体介导的mEPSC。结果:IR&IR大鼠在第二次静脉给药后1天GluA1膜转位程度最强（P<0.05）。与Control组、IR&NS组、IR&I组和IR&R组比较,IR&IR组脊髓GluA1膜转位增加（P<0.05）。与Control组比较,IR&IR组脊髓神经元树突分支、树突棘密度和长度增加,C纤维诱发电位升高,AMPA受体介导mEPSC频率和幅度增加（P<0.05）。在第二次静脉给药后,与IR&IR组比较,IR&IR+NASPM组PWT与PWL升高、痛阈值恢复到基线时间缩短（P<0.05）;脊髓背角GluA1膜转位程度降低,神经元树突分支、树突棘密度和长度减少,C纤维诱发电位降低,AMPA受体介导mEPSC频率和幅度减弱（P<0.05）。结论:大鼠脊髓背角GluA1细胞膜转运增加,使神经元结构改变、突触功能增强,可能会促使瑞芬太尼诱发二次术后痛敏发生。第三部分瑞芬太尼诱发二次术后痛敏大鼠脊髓背角Shank3对神经元可塑性影响及其对GluA1膜转运的调控作用目的:观察瑞芬太尼诱发二次术后痛敏大鼠脊髓背角Shank3表达情况,并探究Shank3表达变化对瑞芬太尼诱发二次术后痛敏大鼠行为学影响,脊髓背角神经元形态、功能影响和对GluA1膜转运的调控作用。方法:本部分Control组、IR&NS组、IR&I组、IR&R组和IR&IR组大鼠处理同第一部分。一、1)IR&IR大鼠第二次静脉给药后2h、6h、1d、3d、7d、14d、18d取L₄-L₆脊髓背角（每个时间点n=8）,应用WB法测定Shank3表达。2)WB法测定Control组、IR&NS组、IR&I组、IR&R组和IR&IR组（N=40,n=8）第二次静脉给药后1天大鼠L₄-L₆脊髓背角Shank3表达。3)免疫荧光法比较Control组和IR&IR组第二次静脉给药1天的大鼠L₄-L₆脊髓Shank3与GluA1共定位情况。二、雄性SD大鼠随机分为5组（N=40,n=8）:（1）Control组;（2）IR&IR组;（3）siRsh3组:由鞘内给予针对Shank3 mRNA的siRNA（siRsh3）;（4）IR&IR+siRsh3组:大鼠经历同IR&IR组相同的处理,并于二次输注瑞芬太尼前2天经鞘内给予siRsh3。（5）IR&IR+Mismatched RNA组大鼠经历同IR&IR组相同的处理,并于二次输静脉给药前2天经鞘内给予错配RNA。1)于处理前后测量大鼠PWT和PWL。2)IR&IR组和IR&IR+siRsh3组第二次静脉给药后1天,WB法检测L₄-L₆脊髓背角GluA1膜转位水平,观察大鼠HFS后脊髓背角C纤维诱发场电位的变化,和高尔基染色观察L₄-L₆脊髓背角神经元形态,以及膜片钳实验观察L₄-L₆脊髓背角AMPA受体介导的mEPSC。结果:IR&IR大鼠在第二次静脉给药后1天脊髓背角Shank3表达最多。与Control组、IR&NS组、IR&I组、IR&R组比较,IR&IR组脊髓Shank3表达增加（P<0.05）。与Control组比较,IR&IR组脊髓背角Shank3与GluA1共定位增加（P<0.05）。在第二次静脉给药后,与IR&IR组比较,IR&IR+siRsh3组大鼠PWT与PWL升高、痛阈值恢复到基线时间缩短（P<0.05）,脊髓背角GluA1膜转位程度降低,神经元树突分支、树突棘密度和长度减少,C纤维诱发电位降低,AMPA受体介导微小兴奋性突触后电流频率和幅度减弱（P<0.05）。结论:瑞芬太尼诱发的二次术后痛敏大鼠脊髓背角Shank3表达增加,并正向调控GluA1膜转运,使神经元结构改变、突触功能增强。第四部分瑞芬太尼诱发二次术后痛敏大鼠脊髓背角Kalirin-7对神经元可塑性影响及其对Shank3-GluA1的调控作用目的:观察瑞芬太尼诱发二次术后痛敏大鼠脊髓背角Kalirin-7表达变化,并探究Kalirin-7表达变化对瑞芬太尼诱发二次术后痛敏大鼠行为学影响,脊髓背角神经元形态、功能影响和对Shank3-GluA1调控作用。方法:本部分Control组、IR&NS组、IR&I组、IR&R组和IR&IR组大鼠处理同第一部分。一、1)IR&IR大鼠第二次静脉给药后2h、6h、1d、3d、7d、14d、18d取L₄-L₆脊髓背角（每个时间点n=8）,应用WB法测定Kalirin-7表达。2)Western Blot检测Control组、IR&NS组、IR&I组、IR&R组和IR&IR组（N=40,n=8）第二次静脉给药后1天大鼠L₄-L₆脊髓背角Kalirin-7表达。二、雄性SD大鼠随机分为6组（N=48,n=8）:（1）Control组;（2）IR&IR组;（3）shRkal7组:由鞘内给予大鼠针对Kalirin-7 mRNA的shRNA（shRkal7）;（4）Negative-LV组:由鞘内给予大鼠慢病毒包裹的阴性shRNA（Negative-LV）（5）IR&IR+shRkal7组:大鼠鞘内给予shRkal7,两周后进行同IR&IR组相同的处理。（6）IR&IR+Negative-LV:大鼠鞘内给予Negative-LV,两周后进行同IR&IR组处理。1)于处理前后测量各组大鼠PWT和PWL。2)IR&IR组、IR&IR+shRkal7组第二次静脉给药后1天,观察大鼠HFS后脊髓背角C纤维诱发场电位的变化,利用高尔基染色观察L₄-L₆脊髓神经元形态变化和膜片钳实验观察AMPA受体介导的mEPSC,WB法检测Shank3表达和GluA1膜转位水平,免疫荧光检测Shank3和GluA1共表达情况,免疫共沉淀检测Shank3和GluA1相互作用情况。结果:IR&IR在第二次静脉给药后1天脊髓背角Kalirin-7表达最多。与Control组、IR&NS组、IR&I组、IR&R组比较,IR&IR组脊髓背角Kalirin-7表达增加（P<0.05）。与IR&IR组比较,IR&IR+shRkal7组PWT和PWL升高,痛阈值恢复到基线时间缩短,脊髓背角Shank3表达减少,GluA1膜转位程度降低,Shank3与GluA1的共表达和相互作用减少,神经元树突分支、树突棘密度和长度减少,C纤维诱发电位降低,AMPA受体介导mEPSC频率和幅度减弱（P<0.05）。结论:瑞芬太尼诱发的二次术后痛敏大鼠脊髓背角Kalirin-7表达增加,并正向调控Shank3和GluA1相互作用和促使GluA1膜转运使,使神经元结构改变、突触功能增强。全文结论:二次术后疼痛比第一次严重。两次手术应用瑞芬太尼镇痛会进一步加重二次术后疼痛,诱发二次术后痛觉过敏不良反应。瑞芬太尼诱发的二次术后痛敏机制可能与脊髓背角Kalirin-7表达升高上调Shank3促进使GluA1突触后膜转运增强,导致兴奋性谷氨酸能神经结构和突触功能重塑引起中枢敏化有关。