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第一部分 晚期非小细胞肺癌患者外周血调节性T/B淋巴细胞相关表型表达的临床研究目的：探讨调节性T淋巴细胞(regulatory T cell,Treg)和调节性B淋巴细胞(regulatory B cell,Breg)相关表型在晚期非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)患者外周血中的表达水平。方法：采集32例晚期非小细胞肺癌患者和20例健康人的外周血样,通过流式细胞仪分析其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中Treg和Breg的比例,分别以CD4+CD25+ CD127-定义Treg、以CD45RA+CD4+CD25+CD127定义幼稚型Treg、以CD 19+CD24iCD27+和CD19+IL-1 0+定义Breg。结果：肺癌患者外周血CD4+T淋巴细胞占PBMC的比例较正常对照组明显下降(P<0.001),肺癌患者外周血Treg(CD4+CD25+CD127-)占CD4+T淋巴细胞的比例较正常对照组无明显差别,肺癌患者外周血幼稚型Treg(CD45RA+CD4+CD25+CD127-)占CD4+T淋巴细胞的比例较正常对照组明显下降(P<0.05)。肺癌患者外周血CD19+B淋巴细胞占PBMC的比例较正常对照组明显下降(P<0.001),肺癌患者外周血Breg(CD19+CD24hiCD27+)占CD19+B淋巴细胞的比例较正常对照组明显升高(P<0.001),肺癌患者外周血Breg(CD19+IL-10+)占CD19+B淋巴细胞的比例较正常对照组明显升高(P<0.05)。结论：晚期NSCLC患者外周血中幼稚型Treg的比例下降,Breg的比例显著上升,两者所参与的负性免疫调控可能协调促进肿瘤的发生、发展。第二部分 肿瘤微环境对调节性T/B淋巴细胞相关表型调控的体外研究目的：探讨肿瘤微环境对调节性T淋巴细胞(regulatory T cell, Treg)和调节性B淋巴细胞(regulatory B cell, Breg)相关表型表达水平的影响,以期明确肿瘤微环境在肿瘤免疫调控中的作用。方法：(1)肺癌细胞株A549以合适密度接种于24孔细胞培养板,24h后将健康人的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)与A549共培养,共培养48h后通过流式细胞仪分析PBMC中Treg和Breg的比例,分别以CD4+CD25+CD127定义Treg、以CD45RA+CD4+CD25+CD127定义幼稚型Treg、以CD19+CD24hiCD27+和CD19+IL-10+定义Breg。(2)A549以合适密度接种于24孔细胞培养板,以不同浓度内毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) (10,100,10000ng/ml)或PBS刺激,在刺激24h后分别收集A549细胞和培养液上清,将健康人的PBMC分别与刺激后的A549细胞或培养液上清共培养,共培养48h后通过流式细胞仪分析PBMC中Treg和Breg的比例。(3)A549以合适密度接种于24孔细胞培养板,以不同浓度LPS (100,500ng/ml) 或 PBS刺激,刺激24h后利用Transwell系统将健康人的PBMC与A549共培养,共培养48h后通过流式细胞仪分析PBMC中Treg和Breg的比例。(4)A549以合适密度接种于24孔细胞培养板,以不同浓度LPS (100,500ng/ml)或PBS刺激,刺激24h后分别收集A549细胞和培养液上清,将晚期肺癌患者的PBMC分别与刺激后的A549细胞或培养液上清共培养,共培养48h后通过流式细胞仪分析PBMC中Treg和Breg的比例。结果：(1)健康人的PBMC与A549共培养后,CD4+ T淋巴细胞的比例上升,Treg占CD4+ T淋巴细胞的比例下降(P<0.01),幼稚型Treg占CD4+ T淋巴细胞的比例下降,CD19+ B淋巴细胞的比例下降(P<0.001), CD19+CD24hiCD27+和CD19+IL-10+ Breg占CD19+ B淋巴细胞的比例上升。(2)健康人的PBMC与LPS刺激A549后所得的培养液上清共培养后,CD4+ T淋巴细胞的比例上升,LPS 100ng/ml时明显上调Treg及幼稚型Treg的比例,CD19+ B淋巴细胞的比例上升,且呈浓度依赖性,而CD19+CD24hiCD27+和CD19+IL-10+ Breg的比例较对照组明显下降。健康人的PBMC与LPS刺激后的A549细胞共培养,CD4+ T淋巴细胞、CD19+ B淋巴细胞、Treg、幼稚型Treg及Breg的比例皆较PBS刺激的对照组上升。LPS刺激A549后的培养液上清对幼稚型Treg及Breg的表达水平影响较激活的A549细胞更显著。(3)健康人的PBMC与LPS刺激的A549在T raswell系统中共培养后,LPS 500ng/ml时明显上调Treg及幼稚型Treg的比例(P<0.05),Breg的比例上升,且呈浓度依赖性。(4)晚期肺癌患者的PBMC与LPS刺激A549后所得的培养液上清共培养后,CD4+T淋巴细胞及Treg的比例较非共培养组明显下降(P<0.01),而幼稚型Treg的比例在LPS100ng/ml时明显上调(P<0.01),LPS 500ng/ml时CD19+IL-10+ Breg的比例较非共培养组显著下调(P<0.05)。晚期肺癌患者的PBMC与LPS刺激后的A549细胞共培养后,CD4+T淋巴细胞较非共培养组明显下降(P<0.001),LPS 500ng/ml时CD19+IL-10+ Breg的比例较非共培养组显著下调(P<0.05)。结论：肺癌肿瘤微环境中细胞-细胞接触或者某些细胞因子的分泌介导调节性T/B淋巴细胞相关表型的调控,炎性激活的肺癌细胞在调控中扮演着重要的角色,而且与炎症的严重程度相关。肿瘤微环境与肿瘤免疫之间可能存在一个动态的网络,相互调控与影响,决定着肿瘤的发生和发展。第三部分 肿瘤微环境调控调节性T/B淋巴细胞相关表型表达的机制研究目的：探讨炎症激活肺癌细胞对调节性T淋巴细胞(regulatory T cell, Treg)和调节性B淋巴细胞(regulatory B cell, Breg)表达调控的潜在机制。方法： (1)肺癌细胞株A549以合适密度接种于24孔细胞培养板,以不同浓度LPS (100,500ng/ml)或PBS刺激,刺激24h后利用Transwell系统将健康人的PBMC与A549共培养,共培养48h后分别收集A549细胞及PBMC,通过逆转录聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction, RT-PCR)检测A549细胞中调节激活正常T细胞表达分泌因子(regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted, RANTES)和巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein, MIP)-1α的基因表达水平,检测PBMC中转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β、干扰素(interferon, IFN)-γ和白细胞介素(interleukin, IL)-4的基因表达水平。 (2)A549以合适密度接种于24孔细胞培养板,以不同浓度核转录因子-κB (nuclear factor κB, NF-κB)通路抑制剂PDTC(10,50,100,300,500μM)或PBS预处理A549细胞后,予LPS以500ng/ml刺激PDTC预处理的A549细胞24h后,利用Transwell系统将健康人的PBMC与A549共培养,共培养48h后通过流式细胞仪分析PBMC中Treg的比例,分别以CD4+CD25+CD127定义Treg、以CD45RA+CD4+CD25+CD127-定义幼稚型Treg。结果：共培养后A549细胞中RANTES和MIP-1a的基因表达水平升高,且与共培养后PBMC中Treg比例变化相一致。共培养后PBMC中TGF-β的基因表达水平下降,而IFN-γ和IL-4的基因表达水平升高。PDTC预处理A549后予LPS刺激,PBMC中CD4+ T淋巴细胞的比例升高,而Treg和幼稚型Treg的比例显著下降,PDTC 300μM时抑制最显著(P<0.001)。结论：肺癌肿瘤细胞来源的趋化因子RANTES和MIP-1α与调节性T/B淋巴细胞相关表型的调控相关。Th1和Th2相关的细胞因子可能与Treg和Breg行使的负性免疫调控作用相关。抑制炎症相关信号通路NF-κB可以显著下调Treg的相对比例,有效的控制肿瘤相关炎症反应可能有利于肿瘤的预后。