研究背景牙髓干细胞具有良好的增殖能力及多向分化能力,是牙组织工程理想的种子细胞。目前大多数的研究聚焦于从健康牙髓组织中分离培养出的牙髓干细胞,然而在那些非健康牙髓中(来自龋病、牙髓炎、牙周炎等患牙牙髓)也可以分离培养出干细胞,均具有间充质干细胞的特性。研究表明从深龋牙髓组织分离培养出的牙髓干细胞与正常牙髓干细胞相比具有更强的增殖以及矿化能力[1]。因此从非健康状态的牙髓组织分离出的牙髓干细胞也可能应用于牙组织工程中。血管为组织提供营养以及氧气,排走代谢废物,血管生成是组织修复以及组织再生的基础。由于髓腔特殊的解剖结构,牙髓被坚固的牙本质包绕,其血运主要来源是通过根尖孔血管,缺乏有效的侧枝循环,牙髓内的血管再生对于牙髓组织修复以及再生是十分关键的一步。目前尚未有深龋牙髓干细胞成血管方面的研究报道,故本实验拟在成血管微环境中探究深龋牙髓干细胞的成血管及矿化特性,探讨其在牙组织工程应用的可能性。材料与方法1.正常与深龋牙髓干细胞生物学特性的研究采用组织块酶消化法从正常牙髓组织和深龋牙髓组织中分离培养牙髓干细胞,将其命名为正常牙髓干细胞(dental pulp stem cells from normal teeth,nDPSCs)与深龋牙髓干细胞(dental pulp sem cells from teeth with deep caries,cDPSCs)。流式细胞仪检测两种组织来源的细胞表面标记物,将两种细胞向成脂、成骨以及成软骨方向诱导分化,检测其多向分化潜能。克隆形成实验检测两种细胞的克隆形成能力,CCK8法检测两种细胞的增殖特性,qRT-PCR检测两种细胞的炎症相关介质表达情况。2.正常与深龋牙髓干细胞在成血管诱导微环境中成血管以及矿化特性的研究利用免疫组化染色检测正常牙髓组织与深龋牙髓组织、正常牙髓干细胞与深龋牙髓干细胞成血管相关蛋白表达情况。取第三代对数生长期的正常牙髓干细胞与深龋牙髓干细胞,成血管方向诱导,qRT-PCR检测成血管相关因子以及矿化相关因子表达情况。Western Blot实验检测两种细胞成血管相关蛋白以及矿化相关蛋白表达情况。结果1.正常与深龋牙髓干细胞的生物学特性本实验成功分离培养了正常牙髓干细胞与深龋牙髓干细胞,流式细胞检测结果显示两种细胞均高表达间充质干细胞表面标记分子,低表达造血干细胞表面标记分子;两种细胞均可向成骨、成脂以及成软骨方向分化,为间充质来源的干细胞。两种细胞均具有克隆形成能力,深龋牙髓干细胞较正常牙髓干细胞具有更强的克隆形成能力(P<0.01)。CCK8结果表明深龋牙髓干细胞增殖能力强于正常牙髓干细胞(P<0.01)。qRT-PCR结果表明深龋牙髓干细胞较正常牙髓干细胞更高表达炎症相关介质(P<0.01)。2.正常与深龋牙髓干细胞在成血管诱导微环境中成血管以及矿化特性的分析与正常牙髓组织相比,深龋牙髓组织更高表达成血管相关蛋白(P<0.01)。在成血管诱导微环境中,深龋牙髓干细胞较正常牙髓干细胞更高表达成血管相关因子以及矿化相关因子(P<0.05)。Western Blot结果也验证了成血管以及矿化相关蛋白在深龋牙髓干细胞有更高表达量。结论1.本实验所分离培养的正常牙髓干细胞与深龋牙髓干细胞均为间充质来源的干细胞,具有多向分化潜能。2.深龋牙髓干细胞较正常牙髓干细胞更高表达炎症介质,并具有更强的增殖能力以及克隆形成能力。3.在成血管诱导微环境中,深龋牙髓干细胞较正常牙髓干细胞有更强成血管以及矿化特性。