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背景:种植体周围龈组与正常牙龈组织是不尽相同的。因为种植体颈部没有附着龈,并且缺乏角化,从而种植体周围炎的发生概率大大增加,随之而来的是种植体周围软硬组织的吸收,影响种植体修复后的舒适性和美观性,甚至导致种植失败。角化龈增量已成为现代牙周病研究和口腔种植学领域的热门话题。对于再生角化牙龈的细胞生物学机制和分子生物学机制尚有很大的研究前景。而炎症刺激,角质细胞的增殖与迁移,上皮的间质变迁都是影响角化上皮再生的重要因素。为了有效控制菌斑,使得消除炎症,我们很迫切地需要研制安全,高效,长效的生物活性分子。目的:至今已有众多科学研究数据肯定槲皮素等类黄酮具有较强的抗氧化性,抗炎性从而促进创面愈合,抑制瘢痕组织增生等功效。槲皮素纳米涂层钛片在体外实验中具有抗炎,抗病原微生物附着,促进牙龈成纤维细胞增殖和促进间充质干细胞分化成成骨细胞等功效。然而尚未有研究槲皮素对人口腔角质细胞(HOKs)的作用。因此我们设计一系列体外实验来验证槲皮素对人牙龈角质细胞的增殖与迁移的药理作用。我们假设槲皮素是通过调节整合素(integrinα6β4)的表达来影响HOKs的增殖与迁移的。至于槲皮素具有抗瘢痕组织形成等功效,我们假设槲皮素的抗瘢痕机理是通过与转化生长因子β(TGFβ)信号通路有关。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg.)是牙周炎的主要致病菌,我们用其脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)来模拟体外炎症环境,并且通过检测炎症因子IL-β1和TNF-α的基因表达来验证槲皮素的抗炎效果。我们有望把槲皮素在牙周组织再生中真正得以应用。方法:(1)体外培养并传代扩增了原代HOKs,本实验用的细胞均于第4代与第五代之间。(2)用CCK-8试剂盒分别检测含有20至200μM的槲皮素对人HOKs的毒性(3)体外检测槲皮素对HOKs增殖能力的影响并与阳性对照表皮生长因子(EGF)做比较(4)进行体外划痕伤创面愈合试验检测槲皮素对HOKs迁移能力的影响,分别在0 h、12 h、24 h和48 h时间点用光学显微镜观察单层细胞创面模型的愈合情况,并与阳性对照EGF做比较(5)用Transwell迁移小室进一步验证槲皮素对HOK迁移能力的影响,24 h后观测HOKs迁移情况,并与阳性对照EGF做比较(6)ELISA法检测创面愈合过程中槲皮素对HOK细胞上清液中TGFβ-1和TGFβ-3的变化(7)利用免疫荧光检测创面愈合初期,TGFβ-3在划痕边缘HOKs上的表达(8)利用Pg.LPS建立体外炎症模型。将HOKs用槲皮素预处理3 h后加入Pg.LPS,48 h后,利用时荧光定量聚合酶链反应(RT-q PCR)检测TNF-α和IL-1β的表达水平,并与阴性对照组和炎症组比较。同时利用RT-q PCR检测在创伤条件下HOKs中生长因子(TGFβ-1,TGFβ-3)的基因表达水平。结果:(1)用CCK-8试剂进行20-200μM不同浓度的槲皮素对HOKs细胞活性的检测。随着浓度的增加,槲皮素对HOKs的细胞活力有明显抑制作用。我们选出20μM的槲皮素来完成余下的实验。(2)槲皮素对HOKs增殖的影响:实验数据显示,在24 h时间点,槲皮素对细胞增殖无明显影响。在48 h时间点,实验组比阴性对照组高6%,但仍无统计学意义。到了72 h时,加入槲皮素的实验组比阴性对照组,增值率升高15%,有明显统计学差异(p<0.01)。Integrinα6β4是基底层HOKs表面特异性表达的细胞黏附受体。已有多个学者提出integrinα6β4是分离和鉴定口腔上皮祖细胞的特异性标记物。我们的q PCR实验数据显示,经过48 h刺激后,槲皮素明显提高integrinα6β4 m RNA水平。由此可以得出槲皮素可能通过促进基底膜HOKs祖细胞增殖来促进牙龈角质细胞的增长。(3)槲皮素对HOKs迁移的影响:划痕实验后12 h内,各组中划痕面积的变化没有明显差距。24 h后,可以观察到槲皮素组比阴性对照组愈合速度明显加快。与阳性对照EGF组相接近。48 h后,划痕愈合率由大到小依次为EGF组,槲皮素组和阴性对照组。(4)为了更进一步验证槲皮素对HOKs迁移的影响,我们进行了Transwell迁移小室实验,实验结果与划痕实验相一致。结果显示槲皮素对HOKs迁移有正向刺激作用(p<0.01)。(5)48 h后,用划痕实验中的HOKs检测槲皮素对TGFβ-1和TGFβ-3蛋白分泌的变化,和基因表达水平。实验结果显示,加入20μM槲皮素48 h后,TGFβ-3的m RNA水平与蛋白质浓度明显比阴性对照组高(p<0.01),而TGFβ-1的分泌量跟阴性对照组相比,尚未检测出明显统计学差异(p>0.05)。(6)槲皮素在体外炎症模型中对HOKs的抗炎效果:数据显示,48 h后,只加Pg.LPS的炎症组中TNF-α和IL-1β的表达与未刺激的阴性对照组相比,有明显增高趋势。含有20μM槲皮素的实验组中,48 h后检TNF-α和IL-1β表达明显降低(p<0.01),由此可以推出在,在体外实验中槲皮素对Pg.LPS引起的炎症具有抗炎作用结论:(1)20μM槲皮素在体外实验中对HOKs无毒性作用(2)20μM槲皮素在48 h和72 h时间点对HOKs增殖有促进作用(3)20μM槲皮素在创面愈合过程中能够促进HOKs的迁移(4)20μM槲皮素在创面愈合过程中能够提高TGFβ-3的表达(5)20μM槲皮素在HOKs创面愈合过程中尚未检测出对TGFβ-1分泌产生影响(6)20μM槲皮素在体外实验中能够抑制Pg.LPS对HOKs引起的炎症反应