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第一部分MPST基因过表达载体的构建及鉴定目的:构建MPST基因慢病毒表达载体,获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)扩增出MPST目的基因并将其克隆到慢病毒表达载体p EB-GFP(T2A)PURO上。将重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒系统(p LP/VSVG、p LP1、p LP2)共转染293T细胞,用获得重组慢病毒液感染SH-SY5Y细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达MPST基因的过表达细胞株(SH-MPST)。用Real-time PCR和Western blot以及ELISA等方法对筛出来的稳转细胞中MPST蛋白表达及功能进行鉴定。结果:与空转组相(SH-PEB)比,稳转组细胞MPST m RNA及蛋白的表达水平显著增加(p<0.01),且细胞MPST酶活性、含量及硫化氢的相对水平显著增加(p<0.01)。结论:成功构建MPST基因慢病毒表达载体并获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,为内源性H2S功能的深入研究奠定基础。第二部分MPST对砷损伤SH-SY5Y细胞的保护目的:探讨MPST基因过表达对SH-SY5Y细胞亚砷酸钠(Na As O2)暴露损伤的影响。方法:实验分空转染(SH-PEB)和过表达(SH-MPST)两组细胞,暴露于Na As O2构建砷损伤神经细胞模型。MTT法、比色法检测染砷细胞活力和Caspase-3活性;Western blot法检测GRP78、CHOP、Bax和Bcl-2等内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)及凋亡相关蛋白表达。结果:经50μM Na As O2处理24h,SH-PEB组细胞活力、Bcl-2的蛋白表达显著降低(p<0.01),而Caspase-3活性、GRP78、CHOP、Bax蛋白表达均显著增加(p<0.01)。相比较,SH-MPST组Bcl-2蛋白表达上调(p<0.01);GRP78、CHOP表达下调;而细胞活力、Bax表达和Caspase-3活性在砷暴露后无显著性差异(p>0.05)。结论:MPST基因过表达能保护神经细胞免受砷诱导的损伤。第三部分ERS参与MPST对GRP78/CHOP通路的影响目的:探讨GRP78/CHOP信号通路参与H2S对砷损伤SH-SY5Y细胞的保护机制。方法:采用ERS阻断剂牛磺熊脱氧胆酸(Sodium tauroursodeoxycholate,TUDCA)预处理24h后,用50μM Na As O2诱导细胞损伤24h。采用MTT、比色法、Western blot法分别检测细胞活力、Caspase-3活性及GRP78、CHOP、Bax和Bcl-2等内质网应激及凋亡相关蛋白的表达。结果:1.砷所诱导SH-PEB组细胞活力的下降、Caspase-3活性的增加、Bcl-2表达的下调、GRP78、CHOP、Bax等蛋白表达上调均可被TUDCA预处理所逆转。2.在SH-MPST组,砷诱导的Bcl-2表达上调、GRP78、CHOP蛋白的表达下调均为TUDCA预处理所逆转;然而,砷和TUDCA对细胞活力、Caspase-3活性与Bax表达均无显著影响(p>0.05)。结论:1.内质网应激是造成神经细胞砷损伤的关键机制;2.GRP78/CHOP通路在MPST拮抗神经细胞砷损伤中发挥重要作用。