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目的:验证活性多肽和阿魏酸对成骨细胞的抗氧化保护作用,探究活性多肽和阿魏酸促进成骨细胞抵御氧化应激所致功能衰退的机理,比较并分析它们调控骨代谢的分子机制。拟为阐明抗氧化与成骨细胞衰老、骨代谢之间的内在联系提供更多的实验基础,为从天然抗氧化分子中筛选骨质疏松(osteoporosis,OP)候选药物提供理论依据,并为临床防治OP提供新思路和新策略。方法:①原代细胞培养:酶消化法分离提取大鼠颅骨成骨细胞并进行体外传代培养,并通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色进行细胞鉴定。②成骨细胞氧化损伤模型的建立:用不同浓度的H2O2损伤细胞lh并通过CCK8法测定细胞存活率从而确定损伤细胞所需的H2O2浓度。③实验细胞分组:取P3代细胞分为正常组(Ctrl),模型组(H2O2),活性多肽Ⅰ组(PP-Ⅰ),活性多肽Ⅱ组(PP-Ⅱ),活性多肽Ⅲ组(PP-Ⅲ)和阿魏酸组(FA)。正常组细胞不做处理,模型组为氧化损伤模型细胞,活性多肽组和阿魏酸组细胞经H2O2损伤后用不同浓度的多肽和阿魏酸处理并通过CCK8法测定细胞存活率,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量测定试剂盒检测ALP分泌水平,并选出适合的作用浓度。④细胞周期检测:活性多肽和阿魏酸作用于细胞72h后通过流式细胞术检测细胞周期。⑤细胞内活性氧水平检测:活性多肽和阿魏酸作用于细胞72h后采用流式细胞术检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量。⑥细胞凋亡检测:选用流式细胞术检测凋亡细胞比例,并采用Hoechst染料对凋亡细胞进行染色。⑦细胞衰老检测:用β-半乳糖苷酶染色试剂盒对细胞进行染色,检测细胞衰老。⑧成骨细胞矿化能力检测:用茜素红(Alizarin Red S,ARS)对各组矿化结节进行染色并拍照。⑨转录组结果分析:对各组结果进行差异分析、GO富集分析、KEGG通路富集分析和趋势分析联合KEGG通路分析。⑩荧光定量PCR检测成骨功能基因和凋亡调控基因的表达情况。11Western-Blot检测成骨功能相关蛋白ALP、成骨相关转录因子(Osterix,OSX)、一型胶原(Collagen-Ⅰ,Coll-1)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、基质金属蛋白酶 1(Matrix metalloproteinase-1,MMP-1)、基质金属蛋白酶 2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2);凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bc12相关X蛋白(Bcl2-Associated X,Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)、蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)、磷酸化蛋白激酶 B(phosphorylated protein kinase B,pAkt)的表达。结果:①镜下观察并经ALP染色和矿化结节茜素染色发现分离得到的原代细胞形态正常,矿化功能较好,说明从大鼠颅骨中提取的细胞为正常成骨细胞。②经CCK8检测筛选出的H2O2氧化损伤造模浓度为100μM。③经CCK8和ALP检测共同筛选出PP-Ⅰ作用浓度为50μM,PP-Ⅱ和PP-Ⅲ作用浓度为20μM,FA作用浓度为640μM。CCK8检测结果表明:H2O2损伤后细胞活性显著减弱(P<0.05)经活性多肽和FA作用后细胞活性明显恢复(P<0.05)。ALP检测结果表明:H2O2损伤后细胞分泌ALP显著减少(P<0.05),活性多肽和阿魏酸作用后各组细胞ALP分泌显著增加(P<0.05)。④细胞周期检测结果表明氧化损伤会显著增加G1期细胞占比(P<0.05),PP-Ⅰ和PP-Ⅲ可显著减少S期细胞(P<0.05)、PP-Ⅱ和FA可显著增加G2期细胞(P<0.05)⑤流式细胞术检测ROS的结果表明氧化损伤能使细胞在较长时间内保持细胞内ROS高水平状态,活性多肽和阿魏酸均能显著降低细胞内ROS水平(P<0.05)。⑥流式细胞术检测细胞凋亡和细胞凋亡荧光染色结果显示:氧化损伤会诱发细胞凋亡(P<0.05),活性多肽和阿魏酸作用后均能明显减少细胞凋亡的发生(P<0.05)。⑦β-半乳糖苷酶染色结果中正常组绿染面积较少着色细胞少,模型组绿染面积大,着色细胞多,活性多肽和阿魏酸作用后均能减少染色面积和着色细胞,其中PP-Ⅰ、PP-Ⅱ、和FA效果较好,PP-Ⅲ效果一般,这表明氧化损伤后大量细胞进入衰老阶段,β-半乳糖苷酶的分泌显著增加(P<0.05),活性多肽和阿魏酸作用后均能延缓细胞的衰老进程,显著减少β-半乳糖苷酶的分泌(P<0.05)。⑧矿化结节茜素红染色结果表明:氧化损伤后的成骨细胞矿化能力弱,不能形成理想的矿化结节,活性多肽PP-Ⅰ组未能形成理想的矿化结节,PP-Ⅱ和PP-Ⅲ组矿化结节较模型组大,颜色较深,总体来说活性多肽不能在21天内恢复细胞的矿化能力,且PP-Ⅰ效果最差,但阿魏酸能在21天内恢复部分矿化能力,使成骨细胞形成较小的矿化结节。⑨Q-PCR结果表明:成骨细胞氧化损伤后Bax、Caspase-3转录明显增加(P<0.05),Runx-2、ALP、骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)、Collagen-Ⅰ、OPN 的转录明显减少(P<0.05),对Bcl-2和OSX的转录无明显影响。活性多肽和FA作用后均能显著减少Bax和Caspase-3的转录(P<0.05),显著增加ALP的转录(P<0.05),除此之外PP-Ⅱ能显著增加Bcl-2、OSX、和OPG的转录(P<0.05),PP-Ⅲ能显著增加OSX和OPG的转录(P<0.05),阿魏酸能显著增加OSX、OPG、Collagen-Ⅰ和OPN的转录(P<0.05),显著减少Bcl-2的转录(P<0.05)。⑩WB结果表明氧化损伤使细胞表达Bcl-2、Collagen-Ⅰ、OPN、Akt和pAkt的量减少,表达Bax、Caspase-3、MMP-1、MMP-2的量增加,阿魏酸作用后以上情况均得到改善,PP-Ⅱ和PP-Ⅲ作用后能改善成骨功能相关蛋白OSX、ALP和Collagen-Ⅰ的表达,改善凋亡相关蛋白Akt、pAkt的表达。11转录组结果表明:与正常细胞相比氧化损伤造模的细胞内有大量基因的表达发生了变化,与氧化损伤造模细胞相比活性多肽和阿魏酸作用于细胞后众多基因的表达也发生了显著变化。根据GO富集分析和KEGG通路富集可知,H202、活性多肽和阿魏酸均改变了细胞的功能和细胞内的某些信号通路。经分析,PP-Ⅱ作用的与成骨功能和细胞凋亡关系密切的细胞通路有细胞外基质受体相互作用(ECM-receptorinteraction),粘着斑粘附(Focal adhesion)、P53 信号通路(P53 signaling pathway)细胞衰老(cellular-senescence)和 PI3K-Akt 信号通路(PI3K-Akt signal pathway),PP-Ⅲ作用的与成骨功能和细胞凋亡关系密切的细胞通路有ECM-receptor interaction,凋亡-多物种(Apoptosis-multiple species),P53 signaling pathway,Focal adhesion和PI3K-Akt signal pathway。阿魏酸作用的与成骨功能和细胞凋亡关系密切的细胞通路有ECM-receptor interaction,Focal adhesion 和 PI3K-Akt signal pathway。结论:活性多肽和阿魏酸均能表现出改善细胞氧化损伤、减少细胞凋亡、延缓细胞衰老、促进成骨相关因子转录的作用。活性多肽促进细胞增殖,改善氧化损伤成骨细胞凋亡、衰老的能力较强,阿魏酸在改善氧化损伤成骨细胞的凋亡、衰老的同时更好的改善细胞分化和矿化能力。PP-Ⅱ的作用机制可能与 ECM-receptor interaction,Focal adhesion、cellular-senescence 和 PI3K-Akt signal pathway 有关。PP-Ⅲ的作用机制可能与 ECM-receptor interaction、Apoptosis-multiple species、Focal adhesion 和 PI3K-Akt signal pathway 有关。阿魏酸的作用机制可能与 ECM-receptor interaction,Focal adhesion 和 PI3K-Akt signal pathway 有关。