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目的和意义动脉粥样硬化(As)对人民健康危害甚大,是老年人主要病死原因之一,随着其发病率越来越高,它也成为社会关注的焦点。动脉粥样硬化一般有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成,纤维组织增生及钙质沉着,动脉中层逐渐蜕变和钙化,病变常累及肌性动脉,一旦发展到足以阻塞动脉腔,则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。作为心脑血脑疾病发病的主要病理基础,动脉粥样硬化是一种进展性炎症性疾病。在动脉粥样斑块中含有大量的炎症介质和单核/巨噬细胞,表明单核/巨噬细胞在这炎症过程中起关键作用。在动脉粥样硬化的经典学说里,白细胞介素被认为在慢性血管炎症反应中扮演着重要的角色。白细胞介素8主要由单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞分泌,对单核/巨噬细胞有趋化作用,促使它黏附于血管内皮,并能吸引中性粒细胞和淋巴细胞进入内皮下间隙,促进平滑肌细胞增生以及增加斑块不稳定性,参与动脉粥样硬化的形成。氧化型密度脂蛋白(ox-LDL)在诱导巨噬细胞凋亡、促脉粥样硬化不稳定性斑块形成的过程中发挥了举足轻重的作用。一系列研究表明,OX-LDL对动脉粥样硬化斑块内的巨噬细胞、内皮细胞等具有重要的细胞毒作用。在AS中,OX-LDL能促进巨噬细胞转变为泡沫细胞,并调节细胞增殖、诱导凋亡,起到启动和放大的作用。动脉粥样硬化是多因素慢性炎症性疾病,炎症介质如CD14、CD36、CD86被发现广泛存在于与动脉粥样硬化相关的各种细胞中,在氧化型低密度脂蛋白协同作用下,它们可诱导基质金属蛋白酶表达,增加内皮细胞的促凝活性,促进炎症因子释放,促进斑块不稳定,介导动脉粥样硬化病理过程。前期研究发现,在AS斑块中有许多凋亡与坏死的细胞如内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞。从凋亡角度看,单核-巨噬细胞比平滑肌细胞、内皮细胞更易于发生细胞凋亡,故其在细胞凋亡中占主导地位,是造成动脉粥样硬化斑块不稳定的重要因素。从这种意义上说,细胞凋亡和细胞增殖之间的平衡决定了动脉粥样硬化斑块的发生、发展。尽管单核-巨噬细胞表面受体CD14、CD34、CD86的作用研究已分别有报道,但是IL-8作用于OX-LDL诱导RAW264.7株的时候,它们之间的作用及对早晚期凋亡的影响是什么,这些研究很少,故值得深入探讨。因此,探索巨噬细胞CD14、CD34、CD86、早期、晚期凋亡与心血管疾病的关系,对疾病的治疗和新药的研发有重大的意义,这也使其成为研究冠心病的新热点。在机体内,细胞因子之间能形成较复杂的网络,它们之间可能存在许多正、负反馈环。在动脉粥样硬化慢性炎症反应中有致炎因子和抗炎因子,它们处于失衡和平衡这矛盾统一体中。参与这些炎症反应的细胞因子有TNF-a、TNF-β、IL-1、IL-10、γ-干扰素等,其中TNF-a、TNF-β、IL-1β、IL-8属于促炎症细胞因子,而IL-10属于抗炎症细胞因子。尽管ox-LDL可刺激单核/巨噬细胞分泌IL-1β的作用已明确,以及IL-10,IL-1β和IL-8在AS中的作用均有相关报道,但是IL-8作用在OX-LDL诱导下的RAW264.7时有什么的效应,它们之间的关系是什么,这些报道很少,值得进一步研究。作为反映炎症状态的指标,它们之间的相互关系以及在AS的发生发展中的作用需进一步明确,这为动脉粥样硬化的防治提供新的思路。OX-LDL诱导的RAW264.7细胞模型,常用于模拟人单核/巨噬细胞在AS中的作用,以期进一步研究动脉粥样硬化病理机制。本实验通过探讨IL-8对OX-LDL诱导的小鼠单核巨噬细胞264.7细胞株(RAW264.7)作用,研究IL-8在动脉粥样硬化病理和发病机制的作用,以寻找到其致病靶点进行干预,为未来的AS的治疗策略带来新的希望。本课题分三部份：第一部份：分组刺激RAW264.7株,48h后收集细胞,用PCR法检测细胞内的IL-8mRNA的表达水平,用WESTERN BLOT检测IL-8蛋白的量是否较对照组明显升高。目的是探讨IL-8与单核/巨噬细胞是否相关,IL-8mRNA合成增多和IL-8蛋白合成是否一致增多,进一步探讨IL-8水平与AS严重程度的关系。第二部份：分组刺激RAW264.7株,48h后收集细胞,分别用流式细胞仪检测CD14、CD34、CD86表位的变化及其早、晚期凋亡率。巨噬细胞表位CD14、CD34、CD86的变化及其早、晚期凋亡的作用均有相关报道,部份促炎因子或多或少与这些表位相关,诱导细胞凋亡,招募更多的炎症因子,促进动脉粥样硬化斑块不稳定性,参与动脉粥样硬化的发生与发展。进一步研究IL8作用在OX-LDL诱导下的RAW264.7时,它们之间的作用关系。第三部份分组刺激RAW264.7株,48h后收集,用ELISA方法检测上清液IL-1β,IL-10浓度。在动脉粥样硬化的慢性炎症反应中,促炎因子和抗炎因子处于失衡和平衡这矛盾统一体中。文献报道IL-1β有促炎作用,而IL-10侧是抑炎作用,进一步研究IL8作用在OX-LDL诱导下的RAW264.7时,它们之间的作用关系。深入研究促炎因子和抗炎因子在AS炎症反应中的变化规律,有助于AS的防治。材料和方法培养RAW264.7株,并将其分为4组：A组(空白组)：不加干预,在培养板上继续培养细胞48小时;B组：用IL-8(多肽片段抗原,100umol/L)刺激细胞48小时；C组：用ox—LDL(200μg/m1)刺激细胞48小时;D组：用ox-LDL(200μg/ml)和L-8(100umol/L)刺激细胞48/小时。制备ox-LDL(200μg/m1)、IL-8(100umol/L)。按上述分组分别刺激RAW264.7株,48h后收集细胞和上清培养液,用PCR法检测其细胞内的IL-8mRNA的表达水平；用WESTERN BLOT检测IL-8蛋白的量是否较对照组明显升高；分别用流式细胞仪检测单核巨噬细胞CD14、CD34、CD86表位的变化及其早、晚期凋亡率；用ELISA方法检测上清培养液IL-1β,IL-10水平。统计学处理统计学处理采用SPSS13.0统计软件,用PCR法检测各组RAW264.7细胞株IL-8mRNA的表达水平和用WESTTERN-BLOT反应检测IL-8蛋白的量；流式法检测各组RAW264.7细胞株CD14、CD34、CD86阳性率,早期凋亡率和晚期凋亡率；ELISA法检测各组培养上清液中细胞因子IL-1β、IL-10含量。上述计量资料用均数±标准差表示,若组间方差齐性,组间比较采用单向方差分析(One-way ANOVA test);若组间差别有统计学意义(P<0.05),组间多重比较用LSD：若组间方差不齐,组间比较采用Welch分析,若组间差别有统计学意义(P<0.05),组间多重比较用Dunnettf s T3。结果1、用Welch分析IL-8mRNA表达水平的增加,组间差别有统计学意义(P<0.05),从Dunnettf’s T3可知,与A组与比较, β、C、D组的增加均有显著差异(P=0.000),而B组和C组没有显著差异(P=0.949)。表明在OX-LDL诱导下,IL-8多肽片段抗原能明显促进RAW264.7细胞株IL-8mRNA的高度表达,起到正反馈的作用。2、用Welch分析IL-8蛋白水平的增加,组间差别有统计学意义(P<0.05),从Dunnettf s T3可知,与A组与比较, β、C、D组的增加均有显著差异(P=0.000),而B组和C组没有显著差异(P=0.182)。表明在OX-LDL诱导下,IL-8多肽片段抗原能明显促进RAW264.7细胞株IL-8蛋白的合成,起到正反馈的作用。3、用Welch分析CD14、CD34、CD86、早期凋亡率和晚期凋亡率的增加,CD86和早期凋亡率P慎分别是0.857、0.952,组间差别无统计学意义(P>0.05)其余CD14、CD34和晚期凋亡率的增加,组间差异有显著差异(P<0.05)。4、用Welch分析各组RAW264.7细胞株培养上清液中细胞因子IL-1β含量的增加,组间差异有显著差异(P<0.05),从Dunnettf s T3可知,与A组相比较,B组、D组的IL-1β均受到促进(P<0.05),B组比C组促进作用更明显(P<0.05)。5、用Welch分析各组RAW264.7细胞株培养上清液中细胞因子IL-10含量的减少,组间差异有显著差异(P<0.05),从Dunnettf’s T3可知,与A组相比较,B、C、D各组IL-10的量受到抑制(P<0.05),但是B、C两组相比较无显著差异(P=0.886)。通过上述三部份的实验,我们可得出以下结论：1、在OX-LDL诱导下,IL-8多肽片段能促进RAW264.7过度表达IL-8mRNA,并且IL-8在信使转导、蛋白的翻译高度一致,提示IL-8不仅参与AS的发生与发展,还通过正反馈促进自身分泌作用,加速AS的发展。2、在OX-LDL诱导下,IL-8多肽片段能促进RAW264.7表位的CD14、CD34,诱导巨噬细胞晚期凋亡,促进动脉粥样硬化斑块不稳定性。3、在OX-LDL诱导下,IL-8多肽片段能促进RAW264.7分泌IL-1β明显增多,明显抑制IL-10分泌,诱导更多巨噬细胞和淋巴细胞的活化,参与动脉粥样斑块中的炎症反应。