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脱支酶是淀粉酶系中重要的酶品,为淀粉彻底水解所必需。目前为止能够高效专一水解淀粉分子中α-1,6糖苷键的脱支酶主要有两种:普鲁兰酶和异淀粉酶。本课题组前期研究中建立了较为完善的地衣芽胞杆菌表达系统,并已成功应用于α-淀粉酶、β-淀粉酶的高效表达,为此,本研究尝试了其对普鲁兰酶和异淀粉酶的异源表达,主要内容如下:以地衣芽胞杆菌Z902（△amy）表达系统为基础,构建了碱性蛋白酶基因缺失的突变菌株Z113,后者胞外蛋白酶活力为前者的21%,明显减少了蛋白酶的分泌,同时碱性蛋白酶基因的缺失对菌体的正常生长影响甚微。普鲁兰酶和异淀粉酶在地衣芽胞杆菌中的游离表达:将含有普鲁兰酶基因的表达载体pBE-pulB,电转化入地衣芽胞杆菌Z902和Z113,进行摇瓶发酵,对比两种重组菌的产酶特征。结果表明,重组菌Z902/pulB的发酵液里没有检测到酶活力,而Z113/pulB的酶活力达41 U/mL,是本实验室前期研究中最高产酶水平的2倍,普鲁兰酶表达水平得到进一步提高,同时表明碱性蛋白酶基因删除的必要性。通过PCR扩增异淀粉酶编码基因iso并克隆入表达载体pHY-WZX,在枯草杆菌1A717中获得重组质粒,将构建好的重组质粒电转化入Z902、Z113中,摇瓶发酵Z902/ISO酶活力达330U/mL,而Z113/ISO酶活力达425 U/mL,实现了异淀粉酶的高效表达。Z113/ISO基本酶学特征分析表明:该重组酶适宜反应条件为50-55℃,pH6.5-9.0;K+、Ca2+、Mg2+离子对其有促进作用,其它离子或化合物强烈抑制其酶活;底物特异性为:支链淀粉>糖原>糯米淀粉>普鲁兰糖。进一步分析了普鲁兰酶和异淀粉酶在水解糊精制备麦芽糖浆中作用,结果,与单独使用β-淀粉酶相比,这两种脱支酶分别和β-淀粉酶复配使用都能够显著提高麦芽糖的生成率,分别达78.61%和76.35%,但异淀粉酶与普鲁兰酶相比,生成的麦芽糖纯度更高,更有助于高纯度麦芽糖浆的制备。-由于游离表达毕竟存在其遗传不稳定性,因此初步研究了普鲁兰酶基因在地衣芽孢杆菌中的整合表达。以质粒pBE-pulB为模板,扩增pulB表达盒,在碱性蛋白酶基因删除突变盒的基础上,将普鲁兰酶表达盒插入到突变盒△apr中,获得重组载体T2-apr::pulB。将该质粒电转化Z902,使pulB基因定点整合到基因组中。经摇瓶发酵和遗传稳定性分析,该重组菌产酶水平为15 U/mL,遗传稳定性为100%。