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研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,居女性恶性肿瘤死亡率的首位。乳腺癌是一种多基因参与的复杂疾病,具有高度异质性,仅凭借传统的组织学特征已不能够满足临床需要。近年来乳腺癌基因研究和个体化治疗取得较大进展,针对人表皮生长因子受体-2(Human epidermal growth factor receptor-2, HER-2, CerbB-2)的靶向治疗取得巨大成功,更好的认识乳腺癌的基因改变为个体化治疗提供了有利条件。我们前期使用定量多基因荧光原位杂交(quantitative multi-gene fluorescence in situ hybridization, QM-FISH)技术检测乳腺癌的遗传不稳定性,结果显示CCND1扩增频繁出现于乳腺癌中。CCND1在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用,其编码蛋白CyclinD1高表达更为普遍。目前,关于Cyclin D1高表达在不同分子分型乳腺癌中的作用机制,其与雌激素受体(Estrogen receptor, ER)阳性乳腺癌预后及对内分泌治疗效果关系的结论尚不一致,尤其是CCND1扩增与CyclinD1过表达之间的关系仍存在争议。本实验旨在证实原发性乳腺癌病例中CCND1扩增/Cyclin D1高表达状况；探讨CyclinD1高表达对CCND1扩增诊断的预测作用,找到与CCND1基因扩增有关的不同CyclinD1蛋白表达水平的Cut-off值；分析CCND1扩增/Cyclin D1高表达在不同分子分型乳腺癌中的表达差异,探究CCND1扩增与浸润性乳腺癌预后及内分泌治疗敏感性的关系,为CCND1成为新的乳腺癌分子标记及治疗靶点提供理论基础。本研究分为两部分。第一部分研究CCND1扩增与浸润性乳腺癌生物学行为的关系以及CyclinDl表达对CCND1扩增诊断的预测作用,第二部分体外细胞实验证实CCND1扩增对乳腺癌内分泌治疗敏感性的影响。方法第一部分：回顾分析临床资料,免疫组织化学(immunohistochemisty, IHC)及荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)方法检测217例原发性乳腺癌中Cyclin D1蛋白及CCND1基因的表达情况,明确两者在乳腺癌中的表达状况及相关关系；分析CyclinD1在不同乳腺癌分子分型中的表达差异,进一步探究其与乳腺癌预后及内分泌治疗敏感性的关系。第二部分：利用真核表达质粒转染人乳腺癌细胞株MCF-7和T47D,沉默CCND1基因,通过real-time PCR及免疫细胞化学检测CCND1基因的干扰效果。将实验组、NC(negative control)组及空白对照组细胞在不同作用浓度的他莫昔芬(tamoxifen, TAM)及托瑞米芬(toremifene, TOR)中共培养72h, MTS法检测细胞的抑制率,计算IC50值,检测CCND1表达下调后乳腺癌细胞对内分泌治疗药物敏感性的变化。结果1.217例原发性乳腺癌中有41例存在CCND1扩增(18.9%), CyclinD1过表达132例(60.8%)；CCND1扩增/CyclinD1过表达在浸润性导管癌(Invasiveductal carcinoma, IDC)和导管内原位癌(Ductal carcinoma in situ,DCIS)中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。2. CyclinDl过表达与CCND1扩增相关(P<0.01),二者表达具有一致性(Kappa=0.510±0.057):ROC曲线分析示CyclinDl+++的Cut-off值为63%;CyclinD1++的Cut-off值为78%。3.Luminal型乳腺癌中CyclinD1高表达/CCND1扩增率明显高于HER-2过表达型,三阴性型乳腺癌均无CCND1扩增；CCND1扩增与ER阳性呈正相关,与HER-2扩增呈负相关。4.ER阳性组中有淋巴结转移的乳腺癌CCND1扩增率(40.4%)高于无淋巴结受累组(19.2%),但两组间差异无统计学意义(P=0.065)5.脂质体瞬时转染MCF-7/T47D72h后CCND1的干扰效率最高(81%,86%)。6.下调CCND1表达后,MCF-7/T47D-shRNA组的IC50值明显低于MCF.7/T47D-NC组和空白对照组(P<0.01)。结论1.CyclinD1过表达广泛存在于原发性乳腺癌中,在DCIS阶段即可出现,且在以后的各阶段及转移灶中保留下来,是乳腺癌发生、进展的一个重要因素。2.CyclinD1高表达在不同的乳腺癌分子分型中存在差异,CCND1扩增与ER阳性相关,HER-2扩增负相关,CCND1有望成为乳腺癌进一步分类的分子标记。3.可通过免疫组化检测CyclinD1蛋白相对表达量来预测基因扩增情况；>63%的肿瘤细胞呈CyclinD1+++,,提示CCND1扩增阳性,>78%的肿瘤细胞呈CyclinD1++,,可认为CCND1扩增阳性。4.CCND1是乳腺癌TAM耐药的分子标记物,对于CCND1扩增的乳腺癌给予抗CyclinD1治疗是必要的。