本试验利用EGFP为转移载体和标志蛋白，对E0蛋白在PK-15细胞内的表达和定位做了初步研究，构建了能稳定表达E0蛋白的PK-15细胞系，为后续的HCLV的全长cDNA转染PK-15细胞和猪瘟兔化弱毒的E0缺失突变株奠定了基础；石门株经兔体480代致弱后，在其基因组的3UTR插入了一个12-nt(ttttttctttttt)的片断，是猪瘟兔化弱毒苗区别于石门株的标志，因此本试验选用PK-15细胞，将HCLV株在PK-15细胞上连续传代34代，以期了解每一代病毒的增殖情况和插入标志12-nt的变化，从而了解HCLV株在细胞上的增殖复制情况。从本试验出发，建议在疫苗生产中，尽量减少传代次数。 1.从猪瘟病毒兔化弱毒株兔体480代后，牛睾丸细胞第3代的细胞毒中提取总RNA，以该总RNA为模板，进行反转录，PCR扩增出了猪瘟病毒兔化弱毒株的囊膜糖蛋白E0基因，琼脂糖凝胶电泳表明其大小与预计相符。将扩增出的E0基因克隆到pGEMT-easy载体中，用自动序列分析仪对其进行序列测定。将测得的序列与从GenBank中选取三株强毒株、三株弱毒株序列进行比较，结果发现，我们测定的HCLV株的E0基因的核酸序列与Brescia的E0基因序列的同源性为94.6％，与Eystrup的E0基因序列的同源性为95.0％，与石门株的E0基因序列的同源性为95.7％，HCLV株与CAP的E0基因序列的同源性为95.4％，与GPE的E0基因序列的同源性为94.5％，与C株的E0基因序列的同源性为98.12％。根据HCLV株的E0基因的核酸序列推导的氨基酸序列与Brescia的E0基因氨基酸序列的同源性为94.7％，与Eystrup的E0基因氨基酸序列的同源性为93.8％，与石门株的E0基因氨基酸序列的同源性为95.2％，HCLV株与CAP的E0基因氨基酸序列的同源性为93.8％，与GPE的E0基因氨基酸序列的同源性为93.0％，与C株的E0基因氨基酸序列的同源性为97.4％。将克隆到pGEMT-easy载体中的E0基因双酶切回收后，连接到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)中，经酶切、PCR、测序后证实，HCLV株的E0基因正确的插入到了EGFP中。 2.利用脂质体分别将高纯度提取的pEGFP-N1Vector和E0目的DNA的重组子利用LipofectamineTM2000转染PK-15、BHK-21、VERO三种细胞，直接在荧光显微镜下用蓝光激发进行观察，在三种细胞中都可以观察到绿色荧光，而且在转染后的24h，48h，72h三个时间点上，观察到的荧光细胞数量逐渐增多，在72h时荧光细胞的数量在三种细胞中都达到最多，总的来看，在PK-15中荧光细胞的数量最多。通过对细胞荧光的定位发现，重组质粒的荧光主要分布在胞浆内，而且细胞核周围的荧光较强，胞核与胞浆的界限明显，尤其是在PK-15细胞和VERO细胞中这种现象尤为明显。未携带E0目的DNA的pEGFP-N1Vector转染三种细胞后，都可以观察到绿色荧光，但是整个细胞中是均匀出现荧光的。 3.经酶切、PCR、单抗间接免疫荧光检测，PK-E0细胞中有大量的HCLV的E0的表达，单纯的PK-15细胞中没有E0的表达。 4.从绘制的猪瘟兔化弱毒疫苗HCLV株在PK-15细胞和PK-E0细胞中增殖的一步生长曲线中可以看出：病毒感染72h的培养液中其滴度达到最高值，随后迅速下降。HCLV株在PK-E0细胞中从48h开始到72h的滴度比在PK-15细胞中的滴度要高。证明PK-E0细胞中的E0蛋白的大量表达增加了HCLV在细胞中的复制。 5.通过将PK-E0细胞连续传代30代，在连续观察期间发现PK-E0细胞在形态、贴壁生长等方面均没有变化，证明获得的PK-E0细胞是稳定的。 6.在PK-15细胞上连续传代获得的HCLV，从第1到第25代病毒的测序结果一致，同源性为100％。从第26代开始在12-nt(ttttttctttttt)插入处出现变化，第26、27代在69位的碱基C的左右各多插入了一个T；第28、29代在碱基C的右侧多插入了多2个T；第30、31代在C的左侧多插入了多6个T，碱基C也变成了T；第32、33代在C的右侧缺失了2个T，碱基C也缺失；第34代在C的左侧缺失了5个T，在C的右侧缺失了5个T，碱基C也缺失，并且在第86位由原来的A变成G，第92位由原来的T变成C。 7.将HCLV1-34代病毒接种24孔板中长满单层的PK-15细胞，于接种后72h进行荧光抗体检查，比较不同代次HCLV在PK-15细胞上增殖的差异。结果发现，从28代病毒滴度有所下降。