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研究背景:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是起源于B细胞系的恶性血液系统疾病,以单克隆浆细胞的异常增生和异常免疫球蛋白的高表达为特征。MM与炎症密切相关,有自身免疫性疾病史、感染病史以及其他炎症性疾病史的患者中,其MM及MGUS发病率更高。目前认为,炎性细胞、免疫细胞及其分泌的细胞因子是骨髓微环境的主要组成部分。MM细胞能够与其中骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)相互调节并“共进化”,形成有利于MM的炎性微环境,从而诱导并促进MM发生发展。BMSCs是MM微环境中白细胞介素6(interleukin6,IL-6)的主要来源,而IL-6又是MM细胞增殖最重要的细胞因子之一。但是反复的炎症过程是如何促使骨髓微环境BMSCs分泌IL-6以及其他重要的炎症因子的具体机制尚未完全阐明。我们的前期研究发现,MM患者血清中促炎因子白细胞介素32(interleukin32,IL-32)表达水平较健康对照明显增高。IL-32也被称为自然杀伤因子4(naturekiller 4,NK-4),是一类包含9种剪接变异体的细胞因子。多项证据显示,IL-32呈现促炎症因子的特性,能够促进IL-6,IL-1β,TNF-α等多种炎症因子的分泌增加,并起到“级联放大效应”。也有研究表明,在实体肿瘤如胃癌、胰腺癌、肾细胞癌等中,IL-32呈高表达,并且被认为是这些疾病的独立不良预后因素。本实验旨在探索IL-32在调控MM骨髓微环境中细胞因子中的作用及其分子机制,以及该网络中各炎性因子的变化对MM细胞基因组不稳定性、细胞增殖、凋亡等的影响。研究目的:1.进一步明确IL-32在MM患者中的表达情况,并探究MM骨髓微环境中IL-32的主要来源;2.研究IL-32诱导的MM骨髓微环境中细胞因子改变的具体情况,并通过构建IL-32敲除的稳转MM细胞株多角度验证其对细胞因子的调节;3.初步研究IL-32调节各种细胞因子释放分泌的分子机制;4.探讨IL-32对于MM细胞生物学功能(增殖、凋亡等)的作用。研究方法:1.ELISA检测并对比MM患者与健康供者外周血及骨髓中IL-32的表达情况,免疫荧光、qPCR等手段检测原代CD138-/CD138+细胞及MM细胞株中IL-32的表达情况;2.以浓度梯度及时间梯度的方式,用重组人同源IL-32α(recombinant IL-32α,r IL-32α)刺激BMSCs,ELISA、细胞因子阵列(cytokine array)等手段检测其IL-6、TNF-α等细胞因子的表达水平变化;通过短发夹RNA(short hairpinRNA,shRNA)构建IL-32敲除的MM细胞株,并将敲除或不敲除IL-32的MM细胞与BMSCs共培养,ELISA检测其细胞因子表达水平的变化;3.以浓度梯度及时间梯度的方式,用rIL-32α刺激BMSCs,Western blot检测细胞内炎症信号通路的活化水平;小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)敲除BMSCs中蛋白酶3(Proteinase 3,PR3)表达后,明确PR3在IL-32诱导激活炎症信号通路中的作用;4.CCK8检测增殖,流式细胞术检测凋亡,Western blot检测DNA损伤效应蛋白,明确IL-32直接或间接介导的MM细胞生物学功能的改变;NOD/SCID小鼠皮下成瘤,体内验证IL-32对小鼠肿瘤负荷的影响。研究结果:1.IL-32在MM患者外周血及骨髓中的表达较健康供者显著增高,免疫荧光、qPCR以及ELISA结果提示其主要来源于其MM患者骨髓中CD138+MM细胞。IL-32在MM细胞株中也广泛表达,其中RPMI8226和OPM2相对高表达,H929、LP-1中相对低表达;2.rIL-32α能够显著促进BMSCs中IL-6的表达,随着其刺激浓度提升(20ng/mL,40ng/mL,80ng/mL and 160ng/mL),BMSCs释放的IL-6较正常情况下提高了3-8倍性;3.RPMI8226细胞株能够促进BMSCs表达并分泌IL-6(360.8±28.4pg/mL vs 177.3±9.4pg/mL,p<0.05),而敲除IL-32的RPMI8226该效应明显减弱(246.7±10.9 pg/mL vs 360.8±28.4 pg/mL,p<0.05);在OPM2细胞株中也存在相同结果;4.Cytokine array检测发现,除IL-6外,rIL-32α能够调控BMSCs中多种炎症因子、趋化因子的表达变化,MIP-1α和MIP-1β等的表达上升,此外,CCL-5,IL-10和VEGF等的表达下降;5.rIL-32α的刺激能够持续激活BMSCs中NF-κB和STAT3炎症信号通路,加入该两条信号通路抑制剂或者敲除BMSCs膜表面分子PR3后,减弱了rIL-32α刺激上述两条信号通路的活化程度及IL-6的分泌;6.rIL-32α直接刺激MM细胞株并未对其增殖、凋亡产生变化;敲除MM细胞株中IL-32后对其增殖及凋亡的变化同样没有直接影响;7.经rIL-32α预处理的BMSCs条件培养基(BCCM)能够显著提升H929和LP-1细胞株的增殖;8.BMSCs/MM细胞株共培养体系中,IL-32的缺失使得BMSCs对RPMI8226和OPM2细胞株的促增殖效应减弱;在小鼠皮下成瘤实验中,IL-32在肿瘤微环境中的缺失也使肿瘤负荷明显降低;9.BMSCs诱导MM细胞株中DNA损伤效应蛋白yH2AX升高,MM细胞株IL-32的缺失减弱该效应。结论:本项研究首次发现并明确IL-32及其受体PR3在MM骨髓微环境中的表达情况。IL-32主要来源于MM细胞,其可溶性成分通过与PR3相互作用,活化BMSCs中炎症相关信号通路NF-κB和STAT3,调节MM骨髓徽环境中IL-6、IL-10、CCL-5和VEGF等多种细胞因子的表达和释放,从而进一步促进MM细胞增殖并诱导其基因组不稳定性形成,在MM发生发展过程中起了重要作用。