水产品中残留呋喃唑酮间接竞争酶联免疫检测(ciELISA)方法建立和氯霉素抗血清制备的研究

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本文分两部分,第一部分研究了将呋喃唑酮(Furazolidone,FZ)与牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)利用改进的重氮化法相偶联,分别作为免疫原及包被原,免疫原注射免疫新西兰白兔获得呋喃唑酮多抗血清,建立了快速检测水产品中残留呋喃唑酮的ELISA方法,并通过对比实验,对检测过程中的各项反应条件进行了优化。第二部分介绍了将氯霉素(Chloramphenicol,CAP)与牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)利用混合酸酐法偶联,分别作为免疫原及包被原,免疫原注射免疫新西兰白兔以获得氯霉素多抗血清,同时对抗血清质量进行了鉴定。第一部分中建立呋喃唑酮间接竞争ELISA法的研究内容在国内属首次报道。第二本内容为本实验室建立快速检测组织中残留氯霉素的ELISA方法奠定了基础。 研究方法和结果如下:用重氮化法将FZ与载体蛋白BSA偶联制备人工抗原FZ—BSA,以此用作免疫原,同法合成包被抗原FZ—HSA。选择常规免疫程序,免疫2~3月龄新西兰白兔,获得多抗FZ抗血清,结果表明抗血清特异性针对FZ。用间接竞争ELISA法对抗血清进行了效价的测定,结果表明抗血清阳性滴度为1:51200~1:102400。同时,采用ELISA方法对抗血清进行了性质鉴定,分别以HSA、FZ—HSA、BSA及FZ—BSA进行包被,结果表明抗血清对HSA包被孔吸光值较低,而对FZ—HSA包被孔吸光值较高,表明抗血清中存在抗FZ抗体。以上结果表明所获得的抗血清基本符合实验要求。 用所制备的抗血清建立了间接竞争ELISA方法。利用对比实验,优化了ELISA的工作条件,方阵滴定法确定的理想呋喃唑酮—人血清白蛋白(FZ—HSA)包被抗原浓度为1.25μg/ml,酶标二抗(羊抗兔IgG—HRP)工作浓度为1:1000以及多抗(FZ—PcAb)血清的工作浓度为1:3200。以上述实验条件为基础,以系列稀释的FZ标准溶液作为检测对象,绘制了标准曲线,从标准曲线可以得知,此方法可测定的最适范围为1ng/ml~100ng/ml,最低检测限约为1ng/ml。本实验所建立的ELISA水产品中残留吱喃哇酮间接竞争醉联免疫检侧(c正USA)方法建立和氛霉t抗血清制备的研究方法的精确度以批内误差(孔间差异)和批间误差(板间差异)来表示,结果表明孔间差异和板间平均差异分别为4.16%和9.20%,这表明方法精确度较好。添加回收率试验测得虾肉样本均回收率为94.86%士9.55%。在可测定浓度范围内,吠喃哇酮伊Z)抗血清与氯霉素(C hioramphenicol)、磺胺二甲啼陡(Sul众口leth画ne)、红霉素(Eryt]俪mycin)、恩诺沙星(E nrofloxacin)、甲氧节睫(TrimethoPrim)等可能会因同时使用而导致共同残留的抗微生物药物未显示免疫交叉反应性,与结构相似物峡喃西林(F~ilinuln)的交叉反应率为43%。.这表明所建立的方法有较高特异性和选择性,适合峡喃哇酮药物残留样本的快速筛选。 氛霉素抗血清制备和鉴定实验中人工抗原合成及抗血清制备的方法基本同上,但考虑到氛霉素分子的化学结构不同于吠喃哇酮以及结合其他学者的研究结论,将氛霉素与载体蛋白偶联的方法改为采用混合酸醉法。结果表明所制备的氛霉素抗血清质量一般:抗体效价一般,阳性滴度(ci EusA法)为1:3200;抗体的特异性一般。其原因可能是人工抗原合成效果不佳或抗体纯化不够所至。本次试验虽没有取得预期结果,但在实验方法和步骤上的摸索,对本实验室将来建立氛霉素残留的酶联免疫检测方法打下了一个基础。
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