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第一部分钟基因BMAL1在舌鳞状细胞癌中的表达及意义目的:研究钟基因BMAL1在舌鳞状细胞癌组织及细胞中的表达水平及临床意义方法:采用qRT-PCR、Western blot以及组织免疫荧光实验检测不同时间段采集的53例舌鳞状细胞癌患者和50例舌部非肿瘤性病变患者的样本中钟基因BMAL1的表达水平;采用Western blot以及细胞免疫荧光检测同步化处理后的舌鳞癌细胞SCC9、SCC25、CAL27和正常舌上皮细胞中BMAL1蛋白在CT0、CT8的表达水平;利用qRT-PCR分析同步化处理后的舌鳞癌细胞SCC9、SCC25、CAL27和正常舌上皮细胞中钟基因BMAL1生物节律变化规律。结果:(1)与正常舌上皮组织相比,三个不同时间段采集的舌鳞癌患者来源的原发灶及癌周组织中钟基因BMAL1表达均降低;(2)与正常舌上皮细胞相比,舌鳞癌细胞SCC9、SCC25、CAL27细胞中钟基因BMAL1表达降低;(3)与正常舌上皮细胞相比,舌鳞癌细胞SCC9、SCC25、CAL27细胞中钟基因BMAL1表达节律重置,主要表现为周期稍缩短、振幅明显降低。结论:钟基因BMAL1在舌鳞状细胞癌组织及细胞中表达下调、生物周期节律重置,提示生物钟基因表达异常以及生物节律紊乱与舌鳞状细胞癌紧密相关,其对舌鳞癌的防治具有重要的指导意义。第二部分钟基因BMAL1对舌鳞癌细胞生物学行为的影响目的:在体内外实验中探讨钟基因BM4L1对舌鳞癌细胞生物学行为的影响。方法:设计构建BMAL1表达质粒及CRISP/Cas9特异性敲除BMAL1质粒,利用脂质体将其转染至舌鳞癌细胞SCC9、SCC25和CAL27,稳定上调或下调BMAL1的表达,以转染空载或者野生型舌鳞癌细胞为对照;首先,分别采用CCK-8法、细胞划痕实验和肿瘤细胞侵袭实验检测上调或下调BMAL1对舌鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响;然后,利用裸鼠皮下成瘤实验在体内检测上调或下调BMAL1对舌鳞癌生长的影响;最后,采用CCK-8法、Annexin VFITC/PI双染法流式细胞术、碘化丙啶单染法流式细胞术及Western blot检测上调或下调BMAL1的舌鳞癌细胞对紫杉醇药物敏感性的影响。结果:(1)构建的BMAL1表达质粒及CRISP/Cas9特异性敲除BMAL1质粒,有效地上调或下调了舌鳞癌细胞中BMAL1的表达,并分别成功筛选出稳转细胞株;(2)CCK-8法、细胞划痕实验和肿瘤细胞侵袭实验显示高表达BMAL1舌鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力均明显下降;(3)CCK-8法、细胞划痕实验和肿瘤细胞侵袭实验显示BMAL1-knockout舌鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力均明显增强;(4)裸鼠皮下成瘤实验证实在体内高表达BMAL1可抑制舌鳞癌生长,而敲除BMAL1可加速舌鳞癌生长;(5)CCK-8法、Annexin VFITC/PI双染法流式细胞术、碘化丙啶单染法流式细胞术及Western blot实验发现高表达BMAL1舌鳞癌细胞对紫杉醇的敏感性增强,细胞增殖抑制及细胞凋亡现象更为明显;(6)CCK-8法、Annexin VFITC/PI双染法流式细胞术、碘化丙啶单染法流式细胞术及Western blot实验发现敲除BMAL1舌鳞癌细胞对紫杉醇的敏感性降低,紫杉醇抑制细胞增殖及促进细胞凋亡的能力减弱。结论:在舌鳞状细胞癌中高表达或敲除BMAL1,可分别抑制或促进细胞增殖、迁移及侵袭;将高表达或敲除BMAL1的舌鳞癌细胞分别植入裸鼠皮下,细胞成瘤的速率明显减慢或加快;舌鳞癌细胞高表达BMAL1可增强细胞对紫杉醇的敏感性,而敲除BMAL1的舌鳞癌细胞对紫杉醇不敏感。第三部分钟基因BMAL1改善紫杉醇药物敏感性的机制研究目的:初步探讨钟基因BMAL1改善紫杉醇药物敏感性的分子调控机制。方法:首先,利用转录组测序比较高表达BMAL1的SCC9细胞与野生型SCC9细胞的差异转录基因,结合qRT-PCR初步筛选出BMAL1改善紫杉醇药物敏感性的靶点TERT;然后,利用qRT-PCR及Western blot探讨在人舌鳞癌组织及细胞中BMAL1与TERT表达量之间的负相关性;其次,构建及转染TERT表达质粒或TERT-shRNA干扰质粒,利用AnnexinVFITC/PI双染法流式细胞术、碘化丙啶单染法流式细胞术及Western blot实验探究过表达TERT能否反转BMAL1增强紫杉醇效果的作用以及下调TERT能否直接降低紫杉醇效果;最后,利用CHIP、Co-IP、免疫荧光双染及双荧光素酶报告实验证实BMAL1对TERT的调控机制。结果:(1)转录组测序发现在BMAL1高表达的TSCC细胞中,TERT表达量显著降低;(2)在舌鳞癌组织及细胞中,利用qRT-PCR及Western blot发现TERT与BMAL1表达量之间呈显著负相关性;(3)在舌鳞癌细胞中,共转染BMAL1与TERT表达质粒可反转BMAL1增强紫杉醇效果的作用,单独下调TERT可直接增强紫杉醇效果;(4)在舌鳞癌细胞中,Co-IP、免疫荧光双染实验证实BMAL1与EZH2在细胞核中共同结合,CHIP实验发现BMAL1募集EZH2共同结合在TERT启动子区域,双荧光素酶报告实验证实BMAL1结合EZH2后可抑制TERT转录,敲除EZH2后BMAL1可促进TERT转录。结论:在舌鳞癌细胞中,证实TERT是BMAL1改善细胞对紫杉醇敏感性的靶标,BMAL1通过下调TERT来增强细胞对紫杉醇的敏感性;随后,机制研究也证实了 BMAL1是募集EZH2共同结合在TERT启动上区域,抑制TERT转录。第四部分钟基因BMAL1与紫杉醇生物时辰治疗的协同性研究目的;探寻钟基因BMAL1与紫杉醇生物时辰治疗协同作用的最佳时机。方法:分别将 SCC9/BMAL1、SCC9/wild type、SCC9/BMAL1-KO 细胞种植于裸鼠皮下,五周后瘤体长大,分别在ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18和ZT22共六个时间点取样,利用qRT-PCR检测肿瘤中BMAL1、TERT表达的生物节律;分别将 SCC9/BMAL1、SCC9/wildtype、SCC9/BMAL1-KO 细胞种植于裸鼠皮下,两周后开始分别在ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18和ZT22六个不同时间点腹腔内注射紫杉醇药物,每周两次、持续四周后取样,比较不同时间点给药,紫杉醇对肿瘤疗效的差异。结果:(1)在SCC9/BMAL1、SCC9/wild type组中,BMAL1表达具有明显的生物节律性变化,而在SCC9/BMAL1-KO组中,BMAL1表达无明显变化;(2)在SCC9/BMAL1组中,BMAL1表达的高峰及低谷分别是ZT10和ZT22,在SCC9/wild type细胞所成肿瘤中,BMAL1表达的高峰及低谷分别是ZT6和ZT18;(3)在SCC9/BMAL1、SCC9/wildtype组中,紫杉醇药效时辰变化与BMAL1表达量基本一致,而在SCC9/BMAL1-KO组中,紫杉醇药效无明显时辰差异。结论:紫杉醇对舌鳞癌的疗效与生物钟基因BMAL1表达量呈现直接正相关,BMAL1是确定舌鳞癌治疗中紫杉醇生物时辰给药最佳时机的直接分子靶标。