论文部分内容阅读
水杨酸(Salicylic acid,SA)是一种广泛存在于植物中的重要激素,可以直接或间接地调节植物的抗病反应、叶片衰老等生命活动。不同植物中的SA含量差异很大。目前,模式植物拟南芥中SA的生物学功能、合成代谢和分解代谢研究地相对比较清楚,而单子叶植物水稻中SA相关的研究尚未取得很大的进展。为了探索SA在水稻中的代谢机制,本文综合运用分子生物学、生物化学、遗传学、植物病理学等研究方法,开展对水稻异分支酸合酶、SA羟基化酶的生物信息学分析和生物学功能研究,鉴定了异分支酸合酶OsICS1、SA羟基化酶OsS5H-1和OsS5H-2在SA代谢中的生物学功能,具体研究结果如下:(1)生物信息学分析结果表明,候选基因OsICS1有异分支酸合成酶家族保守的结构域;候选基因OsS5H-1、OsS5H-2均有2-酮戊二酸依赖性亚铁加氧酶结构域。(2)利用酶活测定方法,以SA为底物测定了 OsS5H-1和OsS5H-2羟基化酶的催化活性,均可以催化SA的羟基化。(3)利用拟南芥转基因技术,成功获得OsICS1、OsS5H-1、OsS5H-2的互补转基因植株 OsICS1-C-1、OsICS1-C-2;OsS5H-1-C-1、OsS5H-1-C-2、OsS5H-1-C-3;OsS5H-2-C-1、OsS5H-2-C-2。(4)利用CRISPRCas9技术和水稻转基因方法,成功获得了 CsICS1的纯合突变体ics1-1、ics1-2、ics1-3;OsSH-1的纯合突变体s5h-1-1 s5h-1-2、s5h-1-3;OsS5H-2的纯合突变体s5g-2-1、sh5-2-2;OsS5H-1的超表达转基因植株OsS5H-1OE-1、OsS5H-1OE-2、OsS5H-10E-3;OsS5H-2 的超表达转基因植株 OsS5H-20E-1、OsS5H-20E-2。(5)利用实时荧光定量技术,对相关基因的表达进行了分析。OCICS1和OsS5H-1在衰老的叶片中表达量高于幼嫩的叶片,而OsS5H-2相反;OsICS1和OsS5H-2均不受SA诱导;OsS5H-1受SA诱导后,表达量增加了 95%;ics1突变体中SA响应基因PR1#051和PR10a的表达量显著低于日本晴。(6)对转基因后代的遗传分析表明,OsICS1-C-1和OsICS1-C-2改变了atsid2(salicylic acid deficent 2)延迟衰老的表型;ics1-1、ics1-2、ics1-3萌发15天后,表现出氧化胁迫病斑的性状,和SA缺失转基因植株NahG表型相似;OsS5H-1-C-1、OsS5H-1-C-2、OsS5H-1-C-3、OsS5H-2-C-1、OsS5H-2-C-2 改变了ats3hs5 瘦小和早衰的表型;s5h-h-1-、s5h-1-2、s5h-1-3的株高低于日本晴,OsS5H-1OE-1、OsS5H-1OE-2、OsS5H-1OE-3的株高明显高于日本晴;分蘖盛期接种白叶枯后,超表达转基因植株均表现为增强的感病性,而s5h-1和s5h-2突变体均未表现出增强的抗病性。(7)对转基因后代代谢分析表明,OsICS1-C-1和OsICS1-C-2中SA的含量显著增加,改变了 atsid2缺失 SA 的表型;OsS5H-1-C-1、OsS5H-1-C-2、OsS5H-1-C-3、OsS5H-2-C-1、OsS5H-2-C-2中SA的含量显著降低,改变了 SA过度积累的表型;15天的ics1-1、ics1-2、ics1-3突变体中SA的含量降低了 67%,而在40天时,SA的含量没有明显变化;超表达转基因植株中SA的含量明显降低,2,5-DHBA明显增加;s5h-1-1、s5h-1-2、s5h-1-3的水杨酸明显增加,2,5-DHBA明显降低;s5h-2-1、s5h-2-2中SA的含量没有明显变化。以上结果表明,OsICS1是水稻幼苗时期SA合成的关键基因;OsS5H-1和OsS5H-2可以催化SA的羟基化;SA和抗病相关。