纤维堆囊菌S.cellulosum So0157-2能够在以滤纸或木聚糖为唯一碳源的无机盐平板上生长。由于纤维素和半纤维素的异质性和复杂性,它们的降解需要多种酶的协同作用,这说明纤维堆囊菌S.cellulosum So0157-2中含有丰富的纤维素和半纤维素降解酶系能够用来降解利用纤维素和半纤维素资源。纤维堆囊菌对不可溶性多糖底物的利用呈现接触性降解的特征。纤维素酶和木聚糖酶活力测定分析表明酶活力主要与细胞相关,而胞外组分活力极低。因此推测相关酶类主要与细胞相结合。已测序的So0157-2基因组分析发现：①基因组中很多多糖降解酶相关基因不具有引导目的蛋白分泌到细胞外的I-型信号肽,这与胞外酶活力极低现象吻合。表明其多糖降解酶类主要不是以分泌到细胞外的游离形式而发生协同作用。②相对于接触性降解的特征而言,So0157-2其基因组中也不含有纤维小体脚手架蛋白、粘附域、锚定域的同源基因序列,暗示着不存在纤维小体结构。因此,基因组信息显示纤维堆囊菌So0157-2降解不溶性多糖的策略既不是胞外游离酶组分的协同作用方式,也不是纤维小体的高效复合体方式,可能采用与两种经典的微生物纤维素降解策略所不同的方式实现其对多糖底物的降解。实验室前期对So0157-2木聚糖酶Xyn11B的分析发现其具有脂蛋白信号肽、多聚丝氨酸区域及糖苷水解酶11家族催化域。因为其前两个特征在目前研究过的多糖降解酶类中较为罕见而成为实验室研究关注的目标。对Xyn11B催化域的活性表达证明该酶组分在原始菌株纤维堆囊菌So0157-2中必然具有相应的生理功能。Xyn11B酶学性质研究中发现其对木聚糖水解产物只有木二糖的外切木聚糖酶特质,也是GH11家族内切木聚糖酶中未见报道过的。So0157-2木聚糖的酶Xyn11B脂蛋白信号肽及分拣序列特征引导的细胞定位与其底物降解特性和生理功能密切相关,也是解析其降解策略的基础之一。脂蛋白信号肽能够指引目的蛋白定位到内膜或外膜上,具体位置与信号肽切割位点后的氨基酸序列相关。实验室前期对纤维堆囊菌So0157-2的木聚糖酶活力进行测定,发现有超过1/2的木聚糖酶活力位于膜组分中,说明定位在膜上的木聚糖酶在木聚糖降解中发挥了重要的作用。本实验希望通过探究脂蛋白信号对木聚糖酶Xyn11B定位的影响,了解其脂蛋白信号肽及切点后的氨基酸序列对定位的影响规律,也会为推测纤维堆囊菌So0157-2的多糖降解方式提供一个证据。本实验对纤维堆囊菌So0157-2木聚糖酶Xyn11B基因的N端脂蛋白信号肽及其切点后的氨基酸序列特征进行了分析,+2到+5位的氨基酸[DGGA]。对纤维堆囊菌So0157-2全基因组中的糖苷水解酶的生物信息学分析预测发现237个糖苷水解酶中有35个属于脂蛋白,237个中有9个为木聚糖酶。GH11家族中所有细菌的木聚糖酶生物信息学预测分析发现有19个属于脂蛋白,其中有5个来源于纤维堆囊菌。由于在本源菌中遗传操作的局限性,我们选择将木聚糖酶Xyn11B进行异源表达,分别选取了与纤维堆囊菌亲缘关系较近的黄色粘球菌DK1622和同为革兰氏阴性菌蛋白异源表达常用的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。设置了Xyn11B基因全长和去掉脂蛋白信号肽的Xyn11B-dlp两个对照实验组。在黄色粘球菌DK1622中,以pZJY41为表达载体,成功构建了pZJY41-X11B和pZJY41-X11B-dlp两个重组表达载体。利用anti-Flag单克隆抗体进行的Western Blot检测,确定了木聚糖酶Xyn11B在粘球菌DK1622表达。组分分离得到胞外浓缩组分(100倍)、细胞全破碎组分、胞内组分和膜组分。在Western Blot检测中,含pZJY41-X11B重组表达载体菌株检测到的强阳性信号在25kDa和33kDa处,分别为木聚糖酶Xyn11B催化域和去掉脂蛋白信号肽后表达产物,主要分布在胞内组分中。含pZJY41-X11B-dlp重组表达载体菌株只在25kDa处检测到阳性信号,主要分布于胞内组分。以上结果表明两个表达载体(pZJY41-X11B和pZJY41-X11B-dlp),无论设计是含有脂蛋白信号肽还是不含有,实际上表达出的蛋白已经从N-端截短,所以脂蛋白信号肽是不发挥作用的,从而使目的蛋白滞留在胞内。超薄切片制备过程中选取4%多聚甲醛-0.5%戊二醛进行菌体固定使菌体结构保存完好。免疫金标记前用10%H2O2刻蚀10min,免疫金颗粒实现对菌体细胞的特异性标记。免疫金标记结果显示含有pZJY41-X11B和pZJY41-X11B-dlp重组表达载体的两株菌的金颗粒都特异性的分布于胞内,与Western Blot检测结果相符合。将Western Blot与免疫金标记结果相结合,目的蛋白不明原因的降解或者剪切致使目的蛋白滞留在胞内,不能确定脂蛋白信号肽对木聚糖酶Xyn11B定位的影响。随后,将木聚糖酶Xyn11B在大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。以pET-22b为表达载体,成功构建了pET-22b-X11B和pET-22b-X11B-dlp两个重组表达载体,获得E.coli (22b)、E.coli (X11B)和E.coli (X11B-dlp)三个菌株。以桦木木聚糖为底物的活性检测确定了目的蛋白的成功表达。通过组分细分得到了胞外浓缩组分、细胞全破碎、胞内组分、周质组分和膜组分。以p-半乳糖苷酶为胞内标志物,测定各组分中β-半乳糖苷酶的含量,说明组分分离过程和方法合适,分离的组分可以用于相应的后续检测。对各组分进行酶活测定,在E.coli (X11B)菌株中,有超过80%的木聚糖酶酶活力存在于膜组分中；在E.coli (X11B-dlp)菌株中,木聚糖酶酶活力在胞内组分和周质组分中分布较高。Western Blot检测中,E.coli (X11B)菌株检测到的强阳性信号在膜组分中；E.coli (X11B-dlp)菌株检测到的强阳性信号在胞内和周质组分中。而在免疫金标记结果中,在E.coli(X11B)菌株中分布于胞内,在膜上并没有预期的特异性金颗粒分布,可能由于蛋白上的His标签被膜上的磷脂分子阻挡不能与抗体发生特异性反应。在E.coli (X11B-dlp)菌株中,周质组分虽有少量金颗粒存在,还不能确定为特异性分布。将E.coli (X11B)和E.coli (X11B-dlp)两株菌检测结果对比说明,脂蛋白信号肽能够发挥指导木聚糖酶Xyn11B的膜定位功能。另外在缺乏脂蛋白信号肽的指引情况下,木聚糖酶Xyn11B出现了周质空间定位的现象,推测可能与其氨基酸序列有关。