大口黑鲈(Micropterus salmoides)俗称加州鲈,隶属鲈形目(Perciformes)、太阳鱼科(Centrarchidae)、黑鲈属(Micropterus),自然分布于美国、加拿大等淡水水域,是北美重要的游钓鱼类。大口黑鲈于20世纪80年代引进中国,由于其肉质鲜嫩且无肌间刺,广温性、生长快及易捕捞等优点,已成为我国重要的淡水养殖品种之一。目前对于大口黑鲈性别决定与性腺分化发育机制了解甚少。Dmrt1基因在多种无脊椎动物和脊椎动物性别决定和分化过程起着重要的作用,是此过程一个重要的转录因子,也是目前已知的在鱼类中最为保守的一个与性别决定有关的基因。本研究基于大口黑鲈转录谱数据,展开大口黑鲈Dmrt1基因的研究,分析其基因结构与功能、预测蛋白结构与功能、了解基因表达情况以及表达位置,为深入开展其在性别决定与分化中的作用研究奠定基础。主要研究内容如下:1.大口黑鲈Dmrt1基因克隆与序列分析在大口黑鲈基因组三代测序数据和性腺转录谱数据中筛选候选基因Dmrt1,分别获得51688 bp的Dmrt1 genomic序列和7011 bp的Dmrt1 cDNA序列。根据此测序结果设计引物进行扩增。对Dmrt1 genomic序列的扩增共得到5段包含有外显子和内含子的序列,其中获得的Dmrt1 5’侧翼区长1517 bp,3’侧翼区长1927 bp。经过多种软件分析顺式作用元件及调控结合位点,其中包括多种性别相关因子以及基因表达调控因子,如转录激活蛋白AP-1、特化蛋白Sp1、性别相关因子Sox/SRY、DM结构域、雌激素相关受体ERR等。对Dmrt1 cDNA序列的扩增共获得cDNA序列6415 bp,含有完整的CDS,在所获得的序列中包含开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)900 bp,5’非翻译区18 bp,3’非翻译区序列5497 bp,经分析ORF编码299个氨基酸。NCBI比对后发现这一基因与其它物种的Dmrt1基因有较高的相似度,如:与黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)和欧洲狼鲈(Dicentrarchus labrax)同源性为89%和88%。且含有与其它物种Dmrt1基因同样的保守功能区DM结构域。因此可以确定该基因为大口黑鲈的Dmrt1基因。将其与其它物种序列进行同源性比对发现,该基因与多个物种的Dmrt1具有较高的同源性,且根据NJ进化树可知,此基因在进化过程中非常保守。使用多个在线生物学软件对蛋白结构进行预测,推测其为亲水性蛋白,不具有跨膜区,且预测其为核内蛋白的可能性最大,其蛋白三级结构预测结果与果蝇Dsx的DM三级结构相似,都可能与锌离子结合,发挥生物学功能。2.大口黑鲈Dmrt1基因表达分析通过半定量与荧光实时定量PCR对大口黑鲈不同发育阶段,包括受精卵、出膜前胚胎不同发育时期、出膜后3 d~40 d的仔鱼、成熟雌雄个体的8种不同组织(心、肝、脑、肌、肠、性腺、鳃、肾),以及3个不同发育时期个体(3月龄、10月龄与14月龄)的精巢、卵巢Dmrt1基因的表达情况进行分析,结果显示大口黑鲈在胚胎时期未检测到Dmrt1的表达,直到出膜40 d才开始检测到Dmrt1的表达。而在成熟个体不同组织中,精巢内的表达量最高,在其它组织中都仅有极微弱的表达。在不同时期的雌雄个体性腺中Dmrt1基因的表达也出现性别二态性,在雄鱼的精巢中Dmrt1为高表达,而在雌鱼的卵巢中表达量很低,且随着卵巢的成熟表达量逐渐下降,这正与精巢中的表达情况相反。结果说明在大口黑鲈中,Dmrt1基因主要与雄性性腺的分化与功能有关。3.大口黑鲈性腺组织学观察及原位表达分析使用地高辛标记的RNA探针对达到性成熟雌雄鱼性腺进行mRNA原位杂交,经NBT显色后显示在早期卵母细胞中有阳性信号,而在成熟卵母细胞中则未检测到;在精巢的各类精细胞(如初级精母细胞、次级精母细胞和成熟精子)中都有较强的阳性信号,且信号主要集中在以上各种类型细胞的核区。这一研究结果表明,Dmrt1主要是在雄性的精巢中发挥作用。本研究确定了Dmrt1为大口黑鲈性别二态性表达的基因,推测在性别分化与性腺发育过程中起关键作用。本研究结果一方面可为大口黑鲈性别决定与性别分化分子机制的深入研究奠定基础;另一方面,通过探索该基因在雌雄大口黑鲈的表达差异,可为生产单性苗种提供理论依据。