贝莱斯芽孢杆菌分离鉴定及其发酵蚯蚓产物对育肥猪抗氧化及免疫功能的影响

来源 :河北农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xxzxzzm
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由于“禁抗,限抗”措施的实施,越来越多的人开始探索替抗物质和替抗策略,芽孢杆菌凭借其诸多优势被作为益生菌应用到畜禽养殖业,本试验从蚯蚓肠道内分离一株菌,经过理化鉴定、分子生物学鉴定等手段确定其种属,通过药敏试验、抑菌试验、抗逆性试验、安全性试验等探究筛选菌株的安全性,用该菌发酵蚯蚓产物饲喂育肥猪,探究发酵产物对猪生产性能、抗氧化及免疫功能的影响,为畜牧养殖业生产新型微生态制剂提供思路。从蚯蚓肠道内分离一株生长快、周围不长霉菌的菌株并命名为Y1,对Y1菌进行生理生化鉴定、16S rRNA测序、生长曲线监测、抗逆性试验、蛋白酶试验、药敏试验、抑菌试验;结果显示:Y1菌能够利用葡萄糖、甘露醇、棉子糖、果糖、麦芽糖、古老糖、D-海藻糖、D-核糖;能水解淀粉和七叶苷,产生过氧化氢酶,能在6.5%的氯化钠中生长等,确定该菌为芽孢杆菌属,16S rRNA测序结果显示该菌为贝莱斯芽孢杆菌,革兰氏染色阳性菌;生长曲线显示该菌6~12 h为对数期,15~17h后处于稳定生长期;在人工胃液、人工肠液中培养10 h,该菌存活率分别达到60.40%和61.60%;能够耐受0.3%胆盐;能产生蛋白酶,在pH值7.0的条件下蛋白酶活力最高,在30℃~60℃的条件下水浴10 min和30 min蛋白酶活力无显著差异(P>0.05),有良好的的热稳定性;对氨苄西林、青霉素G、阿莫西林等耐药,对环丙沙星、头孢羟氨苄、氟苯尼考、替米考星、庆大霉素、红霉素、复方新诺明高度敏感;对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有良好的抑制作用(P<0.05)。在此基础上,对Y1菌进行溶血试验、安全性评价试验、移位试验。将Y1菌接种于血平板培养基,观察该菌有无溶血圈;再将30只SPF级KM小鼠分为空白对照组(K组)、培养基对照组(LB组)和试验组(Y组)分别给予正常自来水、LB空白培养基和浓度不低于1×108 CFU/mL的Y1菌液,试验期间观察小鼠的死亡情况,通过高通量测序分析KM小鼠肠道菌群的变化,是否有细菌位移情况,通过高通量测序分析KM小鼠肠道菌群的变化。结果显示:Y1菌无溶血反应,试验组小鼠脏器无肉眼可见病变,脏器指数与对照组相比无显著变化(P>0.05);通过Alpha指数与Beta指数多样性分析,在门水平上,试验组拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)丰度升高为主要菌群;从属水平看,试验组小鼠肠道中的特异性菌群Muribaculaceae、阿克曼菌属(Akkermansia)丰度升高;稀释性曲线显示试验组群落多样性较高;P coA分析表明试验组菌种相似性较大;细菌无移位情况出现。将蚯蚓粉碎成浆状,用Y1菌对蚯蚓浆进行液体发酵,以SPSS软件设计正交试验,福林酚法测定蛋白酶活性,平板计数法测定活菌数,蛋白酶活性为评价指标,探究试验的最佳发酵时间、菌株接种量、发酵温度及pH值,并优化发酵条件,确定最佳发酵条件。正交试验结果显示:时间36 h、温度27℃、3%接种量、pH 7.0的条件下蛋白酶活力最高,达到45.36 U/mL。按照此发酵条件进行大体积发酵,将发酵产物添加到育肥猪日粮中,探究贝莱斯芽孢杆菌发酵蚯蚓浆对猪生长性能、抗氧化指标及免疫指标的影响。将20头体重相近的健康育肥猪,随机分为4组,每组5头,试验期30 d,空白组K饲喂基础日粮,试验组YD、YZ、YG在基础日粮中分别添加贝莱斯芽孢杆菌发酵蚯蚓浆1%、3%、5%,对育肥猪进行生产性能、抗氧化能力、血常规及免疫功能检测。结果表明:发酵产物对猪试验前后的生产性能和血常规没有显著性影响(P>0.05);与对照组相比,第30d试验组YD、YZ、YG的MDA含量均有显著降低(P<0.05或P<0.01),GSH-Px、CAT、T-AOC含量均有显著升高(P<0.05或P<0.01);与对照组相比,第30 d YZ、YG组的IgA、IgG和TNF-α均显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:从蚯蚓肠道内分离出了一株贝莱斯芽孢杆菌,具有较高的安全性,用该菌发酵蚯蚓浆产物饲喂育肥猪,能提高猪的抗氧化及免疫功能,且日粮中添加5%的比例效果最佳。
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